背景：脑出血是一种常见的脑血管疾病。流行病学调查显示,我国脑出血发病率为(60-80)/10万,占急性脑血管病的18.8-47.6%。在所有的脑血管疾病类型中,脑出血是一类致死率、致残率最高的脑血管疾病,约35-52%的患者在发病后30天内死亡,仅20%的患者在发病六个月后能实现生活自理。虽然脑出血的基础研究方面取得了很大进步,临床治疗方法也在不断完善,但长久以来,患者的预后并未因此得到明显的改善。即使采用创伤较小的显微外科技术手段清除血肿,解除血肿的占位效应,并辅以合理的内科药物治疗,仍难以显著改善患者的临床预后。研究表明,血脑屏障的破坏是脑出血发生后的一个普遍而重要的病理生理变化。脑出血后血脑屏障破坏可以对脑组织产生严重的损害：脑水肿等。脑水肿的严重程度直接与患者的临床预后密切相关。众所周知,血脑屏障是维持中枢神经系统独特内环境稳定的重要结构,是中枢神经系统进行正常生理活动的前提和基础。血脑屏障的基本结构包括：脑毛细血管内皮细胞及其间紧密连接(TJ),内皮基膜及星形胶质细胞终足。其中,脑毛细血管内皮细胞及其间紧密连接是血脑屏障的核心结构。紧密连接在分子结构上是由一组蛋白所构成的复合体。这些分子包括：①跨膜蛋白,主要由occludins, claudins, junction associated molecules (JAM)等蛋白家族构成；②胞浆附属蛋白,主要由zonula occludens (ZO)等蛋白家族构成。细胞膜上这些紧密连接分子元件彼此相互作用并与邻近细胞膜上紧密连接蛋白相聚合、促使胞膜局部“融合”进而形成冰冻蚀刻电镜下紧密连接所表现的复杂三维网状超微结构。血脑屏障结构与功能的完整对于维持神经系统的正常功能至关重要,同时紧密连接结构与功能的变化也是多种神经系统疾病病理生理变化的核心过程。脑出血发生、发展过程中,血脑屏障是如何破坏并导致脑水肿的发生?其分子机制如何?目前这些问题仍不十分清楚。为了探索脑出血后血脑屏障破坏的分子机制,本研究通过建立脑出血动物模型,运用免疫组织化学和免疫荧光染色及qRT-PCR等技术手段,分析了脑出血后血脑屏障紧密连接分子元件occludin和ZO-1的表达变化,探索其表达变化在脑出血后血脑屏障破坏方面可能的作用机制。目的：1.建立合适的脑出血动物模型,研究脑出血后血脑屏障的形态结构变化,为脑出血后血脑屏障的形态学改变提供理论基础。2.研究脑出血后血脑屏障紧密连接重要分子元件的表达变化,从分子水平上阐明脑出血后血脑屏障紧密连接破坏的分子基础及其病理生理意义。方法：1.选择SD雄性大鼠,心脏采血,通过立体定向技术注入其右侧尾状核,建立脑内注入自体血的脑出血动物模型。正常对照组不予任何处理。脑出血组按照不同的时间点分为6h、12h、24h、48h、72h、7d、14d七个亚组；2.采用透射电镜观察脑出血模型及正常对照组中SD大鼠血脑屏障的超微结构特征；3.采用常规HE染色,观察脑出血后血肿周围脑组织的形态学变化；4.运用免疫组织化学和免疫荧光染色观察脑出血后血脑屏障紧密连接蛋白occludin和ZO-1的表达变化；5.采用qRT-PCR的方法探索脑出血后血脑屏障紧密连接occludin和ZO-1mRNA的表达变化；6.定量qRT-PCR结果中样品中occludin和ZO-1mRNA的相对含量。数据均以均数±标准差(x±S)表示,采用SPSS13.0统计软件进行分析。组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),若方差齐则采用F检验；方差不齐采用近似F检验Brown-Forsythe法,组间多重比较采用Tamhane’s T2法,以P≤0.05为差异有统计学意义。结果：1.透射电镜下,正常的脑组织微血管相邻的内皮细胞间可见连续带状的紧密连接,相邻内皮细胞间未见间隙。微血管毛细血管内皮细胞无肿胀,基膜厚薄均匀。在脑出血发生后可观察到多数脑微血管内皮细胞间紧密连接破坏严重,内皮细胞间紧密连接消失,细胞间可见明显裂隙,有些内皮细胞间连接表现为缝隙连接。部分微血管内皮细胞出现肿胀,基膜厚薄不均匀,支持与营养紧密连接的星形胶质细胞终足消失。内皮上偶见窗口形成,内皮细胞胞浆中吞引小泡明显增多。2.HE染色可见,与正常对照组相比,脑出血后血肿周围的脑组织形态发生明显改变。脑出血后6h即可观察到血肿周边脑组织水肿明显,出血后约48h至72h达到高峰,脑出血7d后大鼠脑组织水肿基本消退,并伴有局部明显的胶质增生。同时在大鼠脑内血肿区域可见红细胞及其残片,局部脑组织可见坏死并伴有炎性细胞浸润。3.各组中脑组织微血管内皮细胞间紧密连接蛋白occludin的免疫组织化学染色和免疫荧光染色变化：在正常对照组脑组织中,微血管内皮细胞连接处均可见大量occludin强阳性表达,并呈连续条带状分布；在脑出血发生后6h,即可检测到血肿周围脑微血管内皮细胞间occludin的表达降低,呈弱阳性表达；脑出血发生后24h至72h其表达维持在较低水平,呈阴性或弱阳性表达；随着时间的推移,脑出血动物模型中occludin表达下降的情况逐渐缓解,7d时脑出血组与正常对照组的内皮细胞间紧密连接occludin表达强度无明显差别。不同组别间脑组织微血管内皮细胞间紧密连接蛋白ZO-1的免疫组织化学染色和免疫荧光染色变化：在正常对照组脑组织中,微血管内皮细胞连接处均可见大量的ZO-1表达,呈连续条带状；在脑出血发生后6h至12h,即可检测到血肿周围脑微血管内皮细胞间紧密连接蛋白ZO-1的表达降低,呈弱阳性表达；脑出血发生后48h至72h其表达处于较低水平,呈阴性或弱阳性表达；随着时间的推移,脑组织微血管内皮细胞间的紧密连接蛋白ZO-1表达量缓慢增高,但至出血后7d和14d其表达量仍低于正常对照组。4. qRT-PCR检测脑组织中occludin的mRNA相对含量：与正常对照组(1.0000±0.034145)相比,脑出血组血肿周围脑组织occludin的mRNA相对表达量下降。脑出血6h(0.47701±0.137033)即显著下降,差别具有统计学意义(P=0.004)；出血后12h至72h(分别为0.36493±0.026995,0.47726±0.067762,0.49419±0.137411,0.61418±0.056560)维持在较低水平,与正常对照组相比,差别具有统计学意义(P=0.000,P=0.000,P=0.005,P=0.000)；随着时间的推移,其表达量逐渐增高,至7d(1.08604±0.058944)时,脑出血组与正常对照组相比表达无显著差别,差异无统计学意义(P=0.341)。RT-PCR检测脑组织中ZO-1的mRNA相对含量：与正常对照组(1.00000±0.107914)相比,脑出血组血肿周围脑组织ZO-1的mRNA相对表达量显著下降。脑出血6h(0.70611±0.047096)即显著下降；差别具有统计学意义(P=0.015)；出血后24h至72h(0.47229±0.037842,0.36933±0.022934,0.33094±0.056195)下降最为显著,差别具有统计学意义(P=0.001,P=0.000,P=0.000)；随着时间的推移,其表达量逐渐增高,但至14d(0.74978±0.075473)时,脑出血组的表达量仍显著低于正常对照组,差异有统计学意义(P=0.033)。结论：1.脑出血后血肿周边脑组织的内皮细胞间紧密连接超微结构破坏,血脑屏障通透性增加,血肿周边脑组织形成水肿带。2.脑出血后血肿周边脑组织的内皮细胞间紧密连接蛋白occludin口ZO-1表达下降,这一过程可能参与了脑出血后血脑屏障紧密连接的破坏。