肺癌的发病率和死亡率近年来一直呈上升趋势,已成为21世纪全球面临的严峻的健康问题。在中国,预计到2025年,肺癌患者将达到100万,居世界第1位。研究肺癌的发生、发展及治疗和预后的相关问题一直以来都是医学界面临的重要课题。Tiam1即T淋巴瘤侵袭和转移诱导因子1,是鸟核苷酸交换因子(GEF),与多种肿瘤细胞的侵袭、转移密切相关,如乳腺癌、结肠癌；但也有学者认为Tiam1有抑制肿瘤侵袭转移的作用。有研究表明Tiam1过表达与非小细胞肺癌的发展、淋巴结转移及预后有密切关系,Tiam1的过表达是肝癌、鼻咽癌、前列腺癌独立的预后因子。有关肺癌中Tiam1表达的研究基于定性分析,其量化特点及基于量化改变的变化规律,Tiam1、Ki67和p53蛋白三者联合检测在肺癌预后中的作用,尚未见报道。Ki67是目前应用广泛的细胞增殖标记之一,在人类多种恶性肿瘤中过度表达,对协助诊断、分析预后及指导治疗都具有重要的意义。关于Ki67与肺癌临床病理特征的关系目前意见不一,Ki67与肺癌预后的关系也一直是研究热点。p53基因是一种重要的肿瘤抑制基因,肿瘤的发生、发展和转移与p53基因突变有一定关系。p53突变普遍存在于肺癌癌变的过程中,有研究表明p53的表达与肺癌的临床分期、肿瘤大小、淋巴结转移等相关,但也有研究结果表明他们之间并无明显相关性。为探讨Tiam1、Ki67和p53蛋白在肺癌中的表达,阐明其联合检测在肺癌预后中的意义,并定量揭示Tiaml在肺癌组织中的表达特点及变化规律,我们设计了本课题。目的定量揭示Tiam1、Ki67和p53蛋白在肺癌组织中的表达特点及变化规律,从蛋白量化水平共同探讨Tiam1、Ki67和p53与肺癌的关系,阐明三者联合检测对于肺癌预后的作用。材料和方法一、Tiaml在肺癌细胞及组织中表达的定量分析免疫组织化学技术检测三株肺癌细胞株(A549、GLC-82、H460)、肺癌石蜡组织芯片(包含102例肺癌组织、20例正常成人肺组织、20例胎儿肺组织)、205例肺癌组织、37例肺癌淋巴结转移灶中Tiam1蛋白的表达；用计算机图像分析技术定量测试各例样品中Tiam1蛋白表达的阳性单位(PU值)。实时荧光定量RT-PCR方法检测肺癌细胞株(A549、GLC-82、H460)中Tiam1 mRNA的表达。二、Ki67和p53在肺癌细胞及组织中表达的定量分析免疫组织化学技术检测三株肺癌细胞株(A549、GLC-82、H460)、84例肺癌组织、14例肺癌淋巴结转移灶中Ki67和p53蛋白的表达；用计算机图像分析技术定量测试各例样品中Ki67和p53蛋白表达的阳性单位(PU值)。三、Tiam1、Ki67和p53蛋白表达的相关关系研究205例Tiam1、Ki67和p53蛋白表达的免疫组化检测和定量测试同前；根据染色程度和染色细胞所占百分比进行评分,半定量判定：≥4分为高表达,0～3分为低表达。四、Tiam1、Ki67和p53在肺癌预后中的生存分析采用病例资料摘录和随访研究相结合的方法,收集2000-2006期间在南方医院住院手术治疗的原发性肺癌患者临床和随访资料,结合Tiam1、Ki67和p53蛋白的表达检测结果进行生存分析。结果一、Tiam1在肺癌细胞及组织中表达的定量分析1、H460细胞Tiam1的PU值大于A549、GLC-82细胞Tiam1的PU值,差异有统计学意义(P=0.032,P=0.000)；A549细胞Tiam1的PU值与GLC-82细胞的PU值基本相同,差异无统计学意义(P=0.084)。2、H460细胞中Tiam1 mRNA的表达高于A549细胞和GLC-82细胞,差异均有统计学意义(P=0.000,P=0.000)；A549细胞中Tiam1 mRNA的表达高于GLC-82细胞,但差异未显示出统计学意义(P=0.067)。3、肺鳞癌、腺癌、大细胞癌癌细胞Tiam1的PU值均大于正常成人肺泡Ⅱ型上皮细胞和胚胎肺泡上皮细胞Tiam1的PU值,差异有统计学意义(P<0.05)。肺小细胞癌癌细胞Tiam1的PU值大于正常成人肺泡Ⅱ型上皮细胞和胚胎肺泡上皮细胞Tiam1的PU值,但差异未显示出统计学意义(P=0.254、P=0.283)。正常成人肺泡Ⅱ型上皮细胞Tiam1的PU值,与胚胎肺泡上皮细胞Tiam1的PU值基本相同,差异无统计学意义(P=0.916)。有淋巴结转移的肺癌原发灶癌细胞Tiam1的PU值大于无淋巴结转移的肺癌原发灶癌细胞PU值,差异有统计学意义(P=0.000)；原发灶和淋巴结转移灶之间癌细胞PU值基本相同,差异无统计学意义(P=0.836)。TNMⅢ-Ⅳ期肺癌癌细胞Tiam1的PU值大于TNMⅠ-Ⅱ期肺癌癌细胞PU值,差异有统计学意义(P=0.008)。肺癌癌细胞Tiam1蛋白的PU值与肺癌病人的性别、年龄、大体类型、分化程度无关(P>0.05)。4、肺鳞状细胞癌癌细胞Tiam1的PU值小于肺腺癌、肺大细胞癌及肺小细胞癌癌细胞,差异有统计学意义(P=0.000)；肺鳞状细胞癌癌细胞Tiam1的PU值小于肺腺鳞癌,但差异无统计学意义(P=0.06)。肺腺癌、肺腺鳞癌、肺大细胞癌、肺小细胞癌之间Tiam1的PU值基本相等,差异无统计学意义(P>0.05)。未分化肺癌癌细胞Tiam1的PU值大于中低分化癌细胞的PU值(P=0.011),差异有统计学意义。高分化肺癌与未分化肺癌、中低分化肺癌癌细胞Tiam1的PU值基本相同,差异无统计学意义(P=0.813,P=0.133)。女性患者肺癌癌细胞Tiam1的PU值大于男性患者(P=0.000)；有淋巴结转移的肺癌癌细胞Tiam1的PU值大于无淋巴结转移的肺癌癌细胞(P=0.004)；淋巴结转移灶肺癌癌细胞中Tiam1的PU值大于原发灶中肺癌癌细胞PU值(P=0.001); TNMⅢ-Ⅳ期的肺癌癌细胞Tiam1的PU值大于TNMⅠ-Ⅱ期的肺癌癌细胞PU值(P=0.000),差异均有统计学意义。肺癌癌细胞Tiam1蛋白的PU值与肺癌病人的年龄、吸烟史、肿瘤大体类型和远处转移无关。二、Ki67和p53在肺癌细胞及组织中表达的定量分析1、H460细胞Ki67的PU值大于A549、GLC-82细胞的PU值,差异有统计学意义(P=0.000,P=0.001)；A549细胞与GLC-82细胞之间Ki67的PU值基本相同,差异无统计学意义(P=0.901)。H460细胞p53的PU值大于A549、GLC-82细胞的PU值,A549细胞p53的PU值大于GLC-82细胞的PU值,差异均有统计学意义(P=0.000,P=0.000,P=0.000)。2、有淋巴结转移的肺癌癌细胞核Ki67的PU值大于无淋巴结转移的肺癌癌细胞,转移灶Ki67的PU值大于相应原发灶的PU值,差异有统计学意义(P=0.035,P=0.019)；有淋巴结转移和无淋巴结转移肺癌之间癌细胞p53的PU值基本相同,差异无统计学意义(P=0.556),但转移灶p53的PU值大于相应原发灶PU值,差异有统计学意义(P=0.008)。肺癌癌细胞核Ki67、p53的PU值与患者性别、年龄、吸烟史、肿瘤大体类型、肺癌的分化程度、远处转移和TNM分期无关(P>0.05)三、Tiam1、Ki67和p53蛋白表达的相关关系研究1、从定量及半定量角度分析肺癌组织中Tiam1、Ki67和p53蛋白表达的相关性,结果均显示：Ki67与p53之间呈正相关关系,但是相关关系并不密切(Spearman相关系数为0.209, P=0.003; Pearson相关系数为0.332,P=0.000)；p53与肿瘤最大面积呈正相关关系,但是相关关系不密切(Pearson相关系数为0.153, P=0.028); Tiam1与Ki67、Tiam1与p53、Tiam1和Ki67与肿瘤最大面积之间均无相关性(P>0.05)。2、Ki67和p53蛋白表达一致性分析有统计学意义(P=0.003),但是一致性差(Kappa=0.200); Tiam1与Ki67、Tiam1与p53一致性分析无统计学意义(P=0.949,P=0.714),表明三者一致性差。四. Tiam1、Ki67和p53在肺癌预后中的生存分析1、肺癌患者1-8年生存率分别为80%、59%、42%、34%、30%、22%、17%、13%。2、肺癌患者临床病理特征与患者预后的单因素分析,结果显示：淋巴结转移、TNM分期、化疗、Ki67、Tiam1、Ki67和Tiam1联合检测,Ki67和p53联合检测,Tiam1和p53联合检测,Ki67、p53和Tiam1联合检测这些因素与患者预后的生存时间有关,差异均有统计学意义(P<0.05)。性别、年龄、吸烟史、大体类型、组织学类型、分化程度、p53表达对患者预后的生存时间无显著影响,差异均无统计学意义(P>0.05)。3、Ki67和Tiam1联合检测肺癌a组(Ki67高表达/Tiam1高表达),b组(Ki67高表达/Tiam1低表达),c组(Ki67低表达/Tiam1高表达),d组(Ki67低表达Tiam1低表达)四组患者生存期的变化：a、b、c、d组的中位生存时间分别为18、35、34、54个月,四组生存时间差异有统计学意义(P=0.006)；a组1-8年生存率分别为76%、46%、25%、18%、16%、16%、11%及7%；b组1-8年生存率分别为81%、64%、49%、38%、35%、28%、28%及17%；c组1-8年生存率分别为82%、65%、47%、39%、33%、20%、16%、16%及16%；d组1-8年生存率分别为86%、69%、58%、55%、46%、26%、19%及19%。a、b、c、d四组间3、4、5年生存率比较,差异有统计学意义(P=0.004,P=0.003,P=0.007),其中a组生存率最低,d组生存率最高。四组间1、2、6、7、8年生存率差异无统计学意义(P>0.05)。4、Ki67和p53联合检测肺癌A组(Ki67高表达/p53高表达),B组(Ki67高表达/p53低表达),C组(Ki67低表达/p53高表达),D组(Ki67低表达/p53低表达)四组患者生存期的变化：A、B、C、D组的中位生存时间分别为30、16、31、43个月,四组生存时间差异有统计学意义(P=0.004)；A组1-8年生存率分别为86%、59%、43%、34%、32%、32%、24%及10%；B组1-8年生存率分别为69%、47%、26%、17%、15%、9%、9%及9%；C组1-8年生存率分别为77%、62%、50%、38%、38%、19%、6%及6%；D组1-8年生存率分别为88%、71%、53%、50%、40%、25%、21%及21%。A、B、C、D四组间1、3、4、5、6年生存率比较,差异有统计学意义(P=0.041,P=0.018, P=0.003,P=0.026,P=0.018),其中B组生存率最低,D组生存率最高。四组间2、7、8年生存率差异无统计学意义(P>0.05)。5、p53和Tiam1联合检测肺癌①组(p53高表达/Tiam1高表达),②组(p53高表达/Tiam1低表达),③组(p53低表达/Tiam1高表达),④组(p53低表达/Tiam1低表达)四组患者生存期的变化：①、②、③、④组的中位生存时间分别为20、56、25、27个月,四组生存时间差异有统计学意义(P=0.047)；①组1-8年生存率分别为77%、47%、32%、24%、24%、20%、11%及4%;②组1-8年生存率分别为91%、79%、64%、51%、47%、41%、32%及16%;③组1-8年生存率分别为80%、59%、37%、31%、25%、18%、15%及15%;④组1-8年生存率分别为77%、59%、45%、40%、34%、17%、17%及17%。①、②、③、④四组间2、3、4年生存率比较,差异有统计学意义(P=0.038,P=0.025,P=0.050),其中①组生存率最低,②组生存率最高。四组间1、5、6、7、8年生存率差异无统计学意义(P>0.05)。6、Ki67、p53和Tiam1联合检测肺癌1组(Ki67高表达/p53高表达/Tiam1高表达),2组(Ki67高表达/p53低表达/Tiam1高表达),3组(Ki67高表达/p53高表达/Tiam1低表达),4组(Ki67高表达/p53低表达/Tiam1低表达),5组(Ki67低表达/p53高表达/Tiam1高表达),6组(Ki67低表达/p53低表达/Tiam1高表达),7组(Ki67低表达/p53高表达/Tiam1低表达),8组(Ki67低表达/p53低表达/Tiam1低表达)八组患者生存期的变化：1、2、3、4、5、6、7、8的中位生存时间分别为18、16、56、18、24、34、36、54个月,八组生存时间差异有统计学意义(P=0.002)；1组1-8年生存率分别为78%、42%、28%、22%、22%、22%、11%及4%；2组1-8年生存率分别为73%、49%、24%、16%、13%、13%、13%及13%；3组1～8年生存率分别为96%、81%、65%、53%、49%、49%、49%及24%；4组1～8年生存率分别为62%、43%、29%、19%、19%、6%、6%及6%；5组1～8年生存率分别为75%、56%、44%、29%、29%、15%、15%及15%；6组1～8年生存率分别为86%、69%、49%、43%、36%、22%、17%及17%；7组1～8年生存率分别为80%、70%、60%、50%、50%、25%、0%及0%；8组1～8年生存率分别为92%、75%、58%、58%、45%、27%、27%及27%。1、2、3、4、5、6、7、8八组间2、3、4、5、6、7年生存率比较,差异有统计学意义(P=0.013,P=0.006,P=0.002,P=0.017,P=0.012,P=0.001),其中3组生存率最高。八组间1、8年生存差异无统计学意义(P=0.072,P=0.105)。7、对性别、年龄、吸烟史、大体类型、组织学类型、分化程度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期、肿瘤最大面积、化疗、Ki67PU值、Tiam1PU值、p53PU值、Ki67、Tiam1及p53的独立检测、Ki67和Tiam1的联合检测、Ki67和p53的联合检测、p53和Tiam1的联合检测、Ki67、p53及Tiam1的联合检测进行Cox回归分析,结果显示Ki67和Tiam1联合检测、肿瘤最大面积、TNM分期、化疗为影响肺癌患者生存的独立预后因素(P=0.030,P=0.004,P=0.001, P=0.017)。提示：Ki67、Tiam1同时高表达患者较Ki67、Tiam1同时低表达患者死亡风险大；未进行化疗的患者较进行化疗患者的死亡风险大；肿瘤最大面积越大、TNM的分期越高,死亡的风险越大。结论一、Tiam1蛋白在正常肺组织、胚胎肺组织、肺癌组织中的表达强度存在显著性差异,在肺癌组织中的表达显著高于前两者,说明Tiam1蛋白的表达与肺癌的发生有关；Tiam1蛋白在肺癌细胞和肺癌组织中均高表达,且其表达强度与肺癌的组织学类型、分化程度、有无淋巴结转移和远处转移、TNM分期密切相关；鳞癌中Tiam1的表达明显低于其他组织学类型；伴有淋巴结转移及远处转移、分化程度越低、TNM分期越高的肺癌组织,Tiam1表达越高,说明Tiam1蛋白的表达与肺癌的恶性程度和转移高度相关。二、Ki67蛋白的表达强度与肺癌淋巴结转移密切相关,表达高是转移的标志。三、Tiaml与Ki67、p53蛋白在肺癌中的表达是独立的,Tiam1与Ki67、p53蛋白在肺癌中的表达无相关性,且不存在一致性；肺癌中Ki67、p53蛋白的表达呈正相关,但相关关系不密切,且一致性差；因此可以将三者组合起来,共同探讨其与肺癌预后的关系。四、Ki67蛋白的高表达、Tiam1蛋白的高表达、伴有淋巴结和远处转移、未进行化疗、TNM分期高,均是肺癌患者独立的预后不良的标记。Ki67、p53、Tiam1随机组合检测,以Ki67和Tiam1的组合检测最佳,3年、4年、5年生存率的高低均为：Ki67低表达/Tiam1低表达组>Ki67高表达/Tiam1低表达组、Ki67低表达/Tiam1高表达组>Ki67高表达/Tiam1高表达组。多因素Cox回归模型分析：Ki67和Tiam1联合检测、肿瘤最大面积、TNM分期、化疗为影响肺癌患者生存的独立预后因素；因此,联合检测Ki67、Tiam1的表达水平,能够有效的预测肺癌患者的预后情况。