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研究背景目前大面积深度烧伤患者由于自体皮源不足,难于满足大面积皮肤缺损患者尽早封闭创面的要求,是严重限制烧伤治疗水平提高的重要原因之一。随着发育生物学、分子生物学等生命科学的飞速发展和组织工程、干细胞工程等技术的进步,表皮干细胞（keratinocyte stem cell,KSC）在烧伤创面修复中的作用引起了同行们的广泛关注。表皮干细胞具有强大的增殖能力,又可向各个阶段表皮细胞分化以维持皮肤新陈代谢,因此KSC作为皮肤重建的“种子细胞”成为研究的热点。在体外培养获得足够数量的KSC用于研究及移植,在体内外诱导KSC快速增殖和定向分化,对于研究组织工程皮肤和创面愈合的分子机制具有重要意义,了解KSC增殖与分化的调控机制也是进一步探讨上述问题的关键所在。既往研究表明,整合素β1在KSC增殖与分化中扮演重要角色。在表皮基底层及毛囊隆突部有高水平的整合素β1表达,而这些部位富含干细胞,KSC表面的整合素β1的表达较由KSC分化而来的快速增殖细胞（transit amplifying cell,TAC）高2～3倍,KSC主要通过与基底膜的粘附维持其干细胞特性,若KSC脱粘附,则不可避免走向终末分化,整合素β1被公认为是KSC未分化的分子标记之一。Jones等发现高表达整合素β1的表皮细胞具有更高的克隆形成能力,传代次数显著多于低表达的细胞;本实验室前期通过构建整合素β1小RNA干扰载体,转染KSC,发现下调表达整合素β1蛋白,实验组克隆形成率比对照组降低,促进KSC的分化,这些都提示整合素β1参与KSC的增殖分化的调控。Piero C等人用MG-63细胞株（人骨肉瘤细胞株）研究证实整合素β1表达是由两个启动子区调控,缺少CAAT盒和TATA盒,及高GC含量,且作为转录起始的两个独立启动子存在,促进整合素β1基因表达,产生两种mRNA,他们有相同的编码序列,近端和远端启动子在正常或刺激因素作用下都能促进转录,但具体参与转录水平调控的转录因子及其机制尚不清楚。人表皮细胞株（Human adult skin keratinocytos,HaCaT）来源于正常成人皮肤,是具有完整的表皮分化能力的永生化细胞株。研究表明,将HaCaT移植到裸鼠上,HaCaT可以分化形成上皮组织,表达特异性分化蛋白标志;另外,本实验室前期的研究也表明,整合素β1小干扰RNA载体转染HaCaT能够抑制整合素β1蛋白的表达,生长曲线右移,HaCaT的增殖受到抑制,因此说明HaCaT可以为研究人表皮细胞分化的调控提供一个非常理想的模型。研究目的本研究应用整合素β1启动子荧光素酶报告基因系统,以HaCaT细胞为模型,探讨表皮细胞中整合素β1启动子的活性区域,为进一步研究表皮干细胞的增殖分化机制奠定基础。研究方法1.以本实验室前期构建的含整合素β1启动子序列的重组pGEM-T easy载体为模板,用PCR分别扩增并克隆整合素β1启动子区全长（含近端启动子和远端启动子序列）、近端启动子和远端启动子序列,经测序正确后分别构建荧光素酶报告基因载体pGL3-1756（—1442/+314）、pGL3-261（+54/+314）和pGL3-1442（—1442/—1）,转染HaCaT细胞,检测它们在HaCaT中的启动活性,并比较整合素β1远端与近端启动子在HaCaT中的活性,确定其在HaCaT中的转录调控作用。2.根据第一部分研究结果,确定在启动子中发挥上调表达作用的主要序列区域,再用Tfsitescan软件对该启动子的转录因子结合位点进行分析预测,根据分析结果对其进行切割,构建启动子缺失片段荧光素酶报告基因载体,转染HaCaT细胞并检测荧光素酶活性,分析远端启动子的活性及可能参与转录调控的转录因子。研究结果1.成功构建了整合素β1近端启动子、远端及全长启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-1756（—1442/+314）、pGL3-261（+54/+314）和pGL3-1442（—1442/—1）,经酶切鉴定及序列测定表明,其序列与GenBank DNA序列数据库对比分析序列一致,且插入方向正确;用此三种质粒转染HaCaT细胞都有启动子活性,远端启动子活性与全长启动子活性无显著差异,但明显高于近端启动子活性。2.成功构建了整合素β1远端启动子连续缺失片段荧光素酶报告基因载体,转染HaCaT细胞并检测荧光素酶活性,并进行统计分析表明,远端启动子系列重组质粒pGL3-1442（—1442/—1）、pGL3-602（—602/—1）、pGL3-352（—352/—1）、pGL3-212（—212/—1）、pGL3-270（—602/—232）、pGL3-390（—602/—212）转染HaCaT细胞后,都有一定启动活性,pGL3-840（—1442/—603）无明显启动活性;pGL3-602（—602/—1）片段启动活性最高,明显高于pGL3-1442（—1442/—1）启动子活性。研究结论1.成功构建了整合素β1远端和近端启动子荧光素酶报告基因载体。2.通过荧光素酶活性的分析,在表皮细胞中整合素β1基因主要转录调控区域位于远端启动子。3.成功构建了整合素β1远端启动子连续缺失片段荧光素酶报告基因载体。4.通过荧光素酶活性的分析,在表皮细胞中pGL3-602（—602/—1）启动子片段启动活性最高,而pGL3-352（—352/—1）启动子片段启动活性较低,因此位于其中的—602到—353这个区域的250bp是整合素β1远端启动子的高转录活性区。经生物信息学预测分析转录因子C-Rel可能参与了整合素β1的上调表达。5.整合素β1远端启动子pGL3-602（—602/—1）启动活性明显高于pGL3-1442（—1442/—1）启动活性,说明在启动子区840（—1442/—603）片段中可能存在转录抑制子。