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目的 课题组前期研究发现组蛋白甲基转移酶EZH2(enhancer of zeste homolog 2)在维持卵巢癌细胞干性中起重要作用,且EZH2高表达与卵巢癌干细胞顺铂耐药相关;用PCR芯片筛选发现细胞周期检查点激酶CHEK1(checkpoint kinase 1)可能是EZH2相关下游基因。本研究旨在探讨EZH2是否通过激活CHEK1促进卵巢癌干细胞的顺铂耐药。方法 1.在SKOV3细胞株中采用过表达质粒瞬时上调EZH2的表达。在前期通过动物皮下瘤化疗结合体外成球建立的SKOV3干细胞模型SK3rd中,采用慢病毒CRISPR/Cas9系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)构建稳定下调EZH2的细胞株SK3rd-sgEZH2。2.蛋白免疫印迹实验和qRT-PCR实验检测EZH2表达质粒和CRISPR/Cas9转染后EZH2及CHEK1的表达变化。3.在SKOV3和A2780中采用过表达质粒瞬时上调EZH2的表达,或者采用siRNA(Small interfering RNA)干扰技术瞬时下调EZH2的表达,双荧光素酶报告实验检测EZH2表达水平对CHEK1启动子区转录活性的影响。4.染色质免疫共沉淀实验验证EZH2与CHEK1启动子区的直接结合。5.在SK3rd-sgEZH2细胞中,转染CHEK1过表达质粒(SK3rd-sg EZH2/CHEK1),蛋白免疫印迹实验验证转染效果。6.采用无血清悬浮培养法检测细胞球形体(sphere)的形成能力。7.蛋白免疫印迹实验检测顺铂作用后,细胞DNA损伤标记物yH2AX、CHEK1磷酸化水平及其下游分子p-CDC25C蛋白水平的变化。8.流式细胞术检测细胞周期的分布。9.流式细胞术检测顺铂诱导的细胞凋亡。10.MTT实验和克隆形成实验检测细胞对顺铂的化疗反应性。11.采用SK3rd细胞接种于裸鼠皮下,建立皮下移植瘤模型。成瘤后裸鼠随机分为四组,每组6只,分别为单用顺铂+溶剂对照组、顺铂+DZNEP(EZH2抑制剂)组、顺铂+AZD7762(CHEK1抑制剂)组和顺铂+DZNEP+AZD7762组(三药联用组)。腹腔注射给药4个周期,隔天记录老鼠体重,测量瘤径。12.免疫组织化学染色检测以上四组SK3rd移植瘤中EZH2、p-CHEK1、细胞增殖标记物Ki67、凋亡蛋白Cleaved-caspase 3和DNA损伤标记物γH2AX的水平。结果 1.在SKOV3中上调EZH2后,CHEK1的蛋白水平及mRNA水平均增加;而在SK3rd中下调EZH2后,CHEK1的蛋白水平及mRNA水平均降低。2.双荧光素酶报告实验结果显示:在SKOV3和A2780中上调EZH2,CHEK1启动子区的转录活性增加;下调EZH2后,CHEK1转录活性降低。3.染色质免疫共沉淀结果显示:在SKOV3和A2780中,EZH2能直接与CHEK1启动子区转录起始位点TSS附近的区域(-301 bp~-106 bp和+129 bp~+316 bp)结合。4.蛋白免疫印迹实验验证转染效果:与SK3rd相比,SK3rd-sgEZH2细胞的EZH2和CHEK1的蛋白水平均显著降低;SK3rd-sgEZH2/CHEK1细胞的EZH2水平显著降低,而CHEK1的表达较SK3rd稍有升高。5.悬浮3D培养结果显示,与SK3rd相比,SK3rd-sgEZH2细胞的sphere成球能力显著降低;而与SK3rd-sgEZH2/NC相比,SK3rd-sgEZH2/CHEK1细胞的sphere成球能力增加。6.蛋白免疫印迹实验结果显示:顺铂作用下,SK3rd细胞中CHEK1的磷酸化水平及其下游p-CDC25C的表达显著增加,DNA损伤标记物yH2AX则稍有增加,DNA损伤应答作用显著增强。与SK3rd相比,在Sk3rd中敲除EZH2,DNA损伤应答作用被抑制;而在SK3rd-sgEZH2中上调CHEK1可完全逆转EZH2敲除引起的DNA损伤应答抑制作用。7.流式细胞术结果显示:顺铂作用下,SK3rd细胞中G1期细胞比例显著降低,而S期及G2/M期细胞比例显著升高,细胞周期阻滞作用显著增强。与SK3rd相比,SK3rd-sgEZH2细胞的周期阻滞作用被抑制。而在SK3rd-sgEZH2中上调CHEK1可完全逆转EZH2敲除引起的细胞周期阻滞抑制作用。8.流式细胞术结果显示:在未给铂药处理的SK3rd细胞中,单独敲除EZH2以及敲除EZH2同时上调CHEK1均不影响细胞凋亡;在顺铂处理后,与SK3rd相比,SK3rd-sgEZH2细胞的凋亡率增加,而上调CHEK1可完全逆转敲除EZH2的促凋亡作用。9.MTT实验和克隆形成实验结果显示:与SK3rd相比,SK3rd-sgEZH2细胞对顺铂的耐药性显著降低;而上调CHEK1之后的SK3rd-sgEZH2/CHEK1细胞对顺铂的耐药性又恢复到接近SK3rd的水平。10.皮下移植瘤裸鼠实验结果显示:与单用顺铂相比,顺铂+DZNEP、顺铂+AZD7762、三药联用组移植瘤体积分别下降了26%(P=0.25)、47%(P=0.057)、81%(P<0.001),移植瘤重量分别下降了33%(P=0.34)、49%(P=0.045)、72%(P<0.001)。11.动物移植瘤免疫组织化学实验结果显示:DZNEP和AZD7762可分别有效抑制移植瘤EZH2及p-CHEK1水平;与单用顺铂组相比,顺铂+DZNEP组、顺铂+AZD7762组、三药联用组中Ki67的表达依次降低,而Cleaved-caspase 3和yH2AX的表达水平则依次增加。结论 我们的研究结果表明EZH2通过与CHEK1的启动子区直接结合,激活其转录,进而促进卵巢癌干细胞对顺铂的耐药性。而通过抑制EZH2及CHEK1的功能能够增加卵巢癌干细胞对顺铂化疗的敏感性,为卵巢癌的治疗提供新的思路。