论文部分内容阅读
我国是世界上最大的罗非鱼生产国，在其加工过程中会产生大量的废弃物，目前对这些废弃物并没有很好的利用，造成了大量资源的浪费。罗非鱼加工废弃物内脏中含有大量的蛋白酶资源，尤其是在工业上具有广泛用途的胰蛋白酶。从罗非鱼肠道中分离纯化胰蛋白酶，不仅可充分利用罗非鱼加工废弃物，减少环境污染，也可扩大胰蛋白酶的来源途径。
本文以罗非鱼加工下脚料肠道为原料，对其中的胰蛋白酶进行分离纯化、性质及结构研究，主要内容包括罗非鱼肠道粗碱性蛋白酶的性质、提取及分离纯化；罗非鱼肠道胰蛋白酶和猪胰蛋白酶性质及结构对比研究，旨在为水产胰蛋白酶的应用提供理论依据。主要研究结果如下：
1.罗非鱼肠道中粗碱性蛋白酶最适pH为9.0，最适温度为60℃；此酶在pH6.0～10.0及60℃以下稳定性高；Ca2+及低浓度的Na+对该酶有一定的激活作用，Mg2+、Ba2+、A13+、Zn2+、pb2+、Cu2+、Fe2+等金属离子对该碱性蛋白酶有不同程度的抑制作用；甲醛、丙酮对该酶有强烈的抑制作用；丝氨酸蛋白酶抑制剂甲苯磺酰氟(PMSF)、金属蛋白酶抑制剂(EDTA)、巯基还原剂(DTT)对碱性蛋白酶有较强的抑制作用，通过抑制剂的影响初步判断出粗碱性蛋白酶主要为丝氨酸类蛋白酶，金属蛋白酶以及以二硫键为活性中心的蛋白酶混合物。
2.0.5 mol/L的Tris-HC1缓冲液提取罗非鱼肠道碱性蛋白酶的最佳工艺为：料液比1:12，温度38℃，pH 7.8，CaC12浓度5.0 mmol/L，提取时间38 min，在此条件下提取得到的蛋白酶比活力为6.53 U/mg。酶液经30~％～60％饱和硫酸铵分级沉淀、SephadexG-I00凝胶柱层析、DEAE-DE52阴离子交换层析等纯化步骤后，分离得到胰蛋白酶，其纯化倍数和活力回收率分别为22.08、15.26％，经SDS-PAGE结果表明，纯化蛋白酶达到电泳纯，其分子量为28，000 Da，经Native-PAGE表明纯化得到的蛋白酶由一条多肽链组成；经SDS-底物-PAGE鉴定后发现该酶能被大豆胰蛋白酶抑制剂强烈抑制，而不被碘乙酸、Pepstain A、2-巯基乙醇抑制。
3.罗非鱼肠道胰蛋白酶以TAME和BAPNA为底物的最适pH和最适温度分别为pH 8.0、60℃和pH 9.5、40℃，猪胰蛋白酶以TAME和BAPNA为底物的最适pH及最适温度分别为pH 10.5、35℃和pH 10.0、50℃；以TAME为底物罗非鱼肠道胰蛋白酶在pH 6～10稳定，以BAPNA为底物则在pH 4～11稳定，猪胰蛋白酶以TAME和BAPNA为底物均在pH 2～6稳定；两种胰蛋白酶以TAME为底物均在50℃以下均稳定，而以BAPNA为底物罗非鱼肠道胰蛋白酶在55℃以下稳定，猪胰蛋白酶在40℃以下均稳定；以TAME为底物Ca2+、Na+、K+、Cu2+、Ba2+、A13+、pb2+、Fe3+对罗非鱼肠道胰蛋白酶和猪胰蛋白酶均有不同程度的抑制作用，Mg2+对罗非鱼肠道胰蛋白酶有抑制作用，而对猪胰蛋白酶有一定的激活作用；以BAPNA为底物，Na+、Cu2+、Ba2+对两种胰蛋白酶均有不同程度的抑制作用，Mg2+、K+、Ca2+对罗非鱼肠道胰蛋白酶有抑制作用，而对猪胰蛋白酶有一定的激活作用；两种胰蛋白酶均被SBTI、PMSF强烈抑制，EDTA对猪胰蛋白酶的抑制作用强于罗非鱼肠道胰蛋白酶，碘乙酸及2-巯基乙醇对两种胰蛋白酶抑制作用不强；动力学研究发现罗非鱼肠道胰蛋酶和猪胰蛋白酶以TAME和BAPNA为底物的的Km分别为0.266、0.355 mmol/L和0.591、0.900 mmol/L，说明罗非鱼肠道胰蛋白酶对底物的水解能力强于猪胰蛋白酶。
4.罗非鱼肠道胰蛋白酶的芳香族氨基酸、半胱氨酸和疏水性氨基酸均比猪胰蛋白酶低，酸性氨基酸比猪胰蛋白酶高；罗非鱼肠道胰蛋白酶和猪胰蛋白酶分别在196nm和207nm附近有最大吸收；红外光谱表明两种不同动物来源的胰蛋白酶振动频率存在明显的差别；罗非鱼肠道胰蛋白酶含有26.8％a-螺旋、20.20％β?折叠，25％β? 转角和27.9％无规则卷曲，猪胰蛋白酶含有7.8％a-螺旋、37％β?一折叠，22β?.2％p.转角和33.1％无规则卷曲。