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【研究背景】弥漫性轴索损伤（diffuse axonal injury,DAI）是创伤性脑损伤（traumatic brain injury,TBI）中最常见及危害最大的一种病理类型,是指当头部因外力作用时,由于大脑各部位组织存在质量、密度差异而在脑组织内部产生剪切力、牵拉力导致的一种弥漫性的脑白质轴索损伤。DAI可分为原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤是指外力作用于头部时脑组织内部产生剪切力、牵拉力引起原发性轴索断裂损伤,在损伤当时立即出血。而继发性损伤是指在伤后数小时至数十天内由创伤诱发的轴索局部损伤,经过一系列复杂的病理生理学过程,逐渐发展至轴索断裂,最终导致轴索坏死、崩解。继发性损伤是导致DAI预后不良的主要原因,其损伤机制尚不明确。在临床上,DAI尚无统一的诊断标准和有效的治疗手段。在法医学鉴定中,DAI的诊断也有很大困难。因此,深入研究DAI的发病机制,寻找可能的敏感的分子标记,对指导DAI的法医学鉴定有很大的潜在应用价值,同时对改进该病的临床诊治方法也具有重要意义。DAI的发生发展过程中包含了机械力信号和生化信号之间的转导。研究显示力信号与生化信号转导最可能的途径有2种,一种是力敏感受体途径,而另一种是力敏感的离子通道途径。机械敏感TRP离子通道（Mechanosensitive transient receptor potential channels）是一种常见的力敏感离子通道,也是细胞力学信号转导的重要途径之一。该类离子通道属于非选择性阳离子通道,在人体分布广泛,几乎表达于所有组织和细胞类型。目前已发现哺乳动物的TRP通道有六个亚族,即TRPA、TRPC、TRPM、TRPP、TRPV。其中TRPC1是TRPC亚族中的成员之一,在人体内大多数细胞中均有表达。研究发现TRPC1可以介导细胞膜拉伸时Ca2+、Na+等阳离子的内流。而快速、大量的Ca2+内流导致的Ca2+超载正是公认的DAI发病的中心环节。Ca2+超载可以引起轴索内不可逆的微丝、微管结构紊乱,进而引起轴索的肿胀、断裂。Ca2+超载还可以导致线粒体的损伤,导致线粒体膜电位下降,通透性转换孔开放,释放促凋亡因子,进而诱导细胞发生凋亡。综上所述,既参与了力信号与生化信号转导,又能介导Ca2+内流的机械敏感TRPC1离子通道很可能在DAI发展过程中起到了重要的调控作用。基于上述研究进展,本研究通过建立皮质神经元牵拉损伤模型体外模拟DAI损伤,初步探索机械敏感TRPC1通道在牵张力致神经元损伤中的调控作用。【研究目的】1、通过牵拉损伤皮质神经元建立DAI细胞模型,观察轴索损伤后的生化指标变化,检测LDH的表达水平和变化规律;2、初步探讨DAI损伤后的神经元中细胞骨架,线粒体膜电位,胞内活性氧生成量的变化情况;3、初步探讨TRPC1通道在DAI后神经元损伤中的调控作用。【研究方法】1、原代培养皮质神经元,采用神经元烯醇化酶NSE免疫荧光进行神经元纯度鉴定。选择纯度高,生长状态良好的神经元随机分组,参照Ellis方法建立DAI神经细胞牵拉损伤模型。前期研究已表明硅胶膜形变距离为10mm时可以对神经细胞造成牵拉损伤,引起轴索的形态学改变。本实验在在损伤后0h、4h、12h、24h及48h分别取培养基上清液,检测LDH含量变化对牵拉损伤造模情况进行再次验证。2、根据是否添加TRPC1抑制剂GsMTx-4将原代培养皮质神经元分为药物干预组和对照组。其中药物干预组在添加抑制剂后进行损伤造模,并根据损伤后不同时间点分为0h组、4h组、12h组、24h组及48h组,形变距离统一为10mm。对照组除未添加抑制剂外,其余处理与药物干预组相同3、通过微丝蛋白和微管蛋白免疫荧光双标染色,观察药物干预组和对照组损伤后不同时间段神经元细胞骨架变化情况。4、通过JC-1染色,观察药物干预组和对照组损伤后不同时间点神经元线粒体膜电位变化情况。5、通过DCFH-DA荧光探针检测,观察药物干预组和对照组不同时间点细胞内活性氧浓度变化情况。【研究结果】1、本实验使用形变量统一为10mm,形变时间1s对硅胶膜上的神经元进行牵拉后。损伤后0h可见部分神经元轴索扭曲呈“S”型,少量神经元轴索发生断裂。至48h,神经元死亡严重,出现细胞空泡变,轴索数量减少,形态不清,部分轴索增粗、扭曲、断裂、甚至发生崩解。经过牵拉损伤后上清液中的LDH含量有较明显的升高。而对照组的上清液LDH含量基本保持稳定。2、检测加力前后β-tubulin荧光强度,发现β-tubulin荧光强度在加力后呈不稳定的轻微上升趋势。但向DAI模型中加入TRPC1拮抗剂GsMTx-4,并未能显著逆转β-tubulin表达强度变化。以F-actin指示神经元轴索,对照组比药物干预组神经元轴索密度低,在12～48 h组尤为明显。对照组加力后轴索长度随着经历时间增加而变短,使用TRPC1抑制剂干预后轴索长度下降趋势有所缓解。3、可见在牵张力作用后,神经元线粒体膜电位出现了即时性下降（0h）,随着加力后时间的延长,神经元线粒体膜电位有一定程度的恢复,但并未恢复至加力前水平。向神经元加入TRPC1抑制剂GsMTx-4后进行检测发现加力后线粒体膜电位并未出现即时性下降,虽然随着加力后时间的延长有轻微的下降,但到加力后24小时的时候,线粒体膜电位逐渐恢复,而后48小时恢复到加力前的水平。4、发现对照组伤后0h时活性氧含量轻微升高,4h时出现降低,12h时恢复至损伤前水平,后逐渐降低。药物干预组的活性氧含量变化幅度较轻微。0h时药物干预组与对照组的差异较为明显。【研究结论】1、成功建立牵张力致神经元损伤细胞模型;2、牵张力对神经元的作用可导致迟发性轴索断裂,使用TRPC1抑制剂可以改善轴索迟发性断裂情况;3、牵张力对神经元的作用可导致线粒体膜电位降低,使用TRPC1抑制剂可以改善伤后线粒体膜电位降低的情况。