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背景电离辐射诱导机体发生急、慢性炎性反应,进而破坏机体免疫平衡,并表现为淋巴细胞中各细胞亚群的比例失衡,Treg细胞作为淋巴细胞的重要免疫调节亚群,在辐射照射后细胞数目、比例及表型的改变将直接影响机体免疫平衡,为此近年来已有学者对Treg细胞辐射敏感性方面开展了初步研究,但随着对Treg细胞研究的进一步深入,明确了许多与Treg细胞表型和功能相关的转录因子与表面分子,而这些分子的差异表达往往与炎性反应类型和所在的器官不同而不同,其中哪些因子在辐射诱导的炎性反应中发挥作用尚未见相关研究报道。目的分析不同剂量丫射线照射对淋巴细胞及其Treg亚群细胞数和细胞比例的影响,并在此基础上明确2Gyγ射线照射对Treg细胞凋亡率、增殖能力及Treg细胞表型的影响,进而分析Treg细胞凋亡与表型改变之间的关系和靶向作用于差别表达表型因子的microRNA的表达变化,探讨表型改变及其潜在作用的基因水平调控机制,为辐射诱导免疫失衡的预防与恢复治疗提供理论依据。方法1.利用不同剂量(0.25Gy,0.5Gy,0.75Gy,1Gy,2Gy和5Gy)60Coy射线全身照射小鼠,分离胸腺和脾脏中的淋巴细胞并进行计数,再利用FACS检测Treg细胞亚群的比例变化；2.2Gy γ射线照射离体小鼠胸腺淋巴细胞,在照后9h利用FACS检测Treg细胞及Tcon细胞中7-AAD的结合水平；3.2Gy γ射线全身照射小鼠,在照后1、4和10d分离胸腺和脾脏淋巴细胞,利用FACS检测Treg细胞及Tcon细胞Annexin-V和Ki-67的表达,检测Treg细胞核心转录因子FOXP3的表达,检测Treg细胞表型因子CD39、CD103等的表达,检测nTreg细胞特异性转录因子Helios的表达,检测凋亡相关因子Bcl-2、 Bax的表达；4.检索靶向作用于CD39的microRNAs,并利用real-time PCR对检索到的microRNAs进行扩增分析,扩增底物为从分选的CD4+T细胞中提取的RNA；5.分选CD4+CD25+Treg细胞,利用ATP检测试剂盒检测Treg细胞内ATP水平。结果1.小鼠受照后胸腺细胞和脾脏细胞呈剂量依赖性减少,在照后4d降至最低(F=118.08、144.01,p<0.05)。较高剂量(1-5Gy)照射后,胸腺中Treg细胞数随时间逐渐减少,而脾脏中该细胞亚群逐渐恢复；而较低剂量照射后胸腺中Treg细胞数有所增加。与0Gy组相比较,Treg细胞比例随剂量增加而增加(F胸腺=5.16、89.44、3.01,p<0.05；F脾脏=52.02、32.13、27.45,p<0.05)；2.离体Treg细胞自然存活率低于Tcon细胞,2Gy γ射线照射后,二者存活率均减小,后者减小幅度显著(t=-14.03,p<0.05)；3.全身受照后4d, Treg细胞凋亡率显著增加,且高于Tcon细胞；不同器官中Treg细胞凋亡率和增殖水平改变不同,一方面胸腺Treg细胞凋亡率低于脾脏,另一方面胸腺中Ki-67+Treg细胞比例在受照后1d先减小,至照后4d又增加,而脾脏中该比例先增加,至照后4d相对对照组有所恢复；4.受照后FOXP3+Treg细胞占CD4+T细胞的比例增加,单个细胞中FOXP3的MFI变化在胸腺中下调,在脾脏中上调,但均在受照后10d改变最为显著(t=3.22,-5.34；p<0.05)；而Helios的表达相对稳定,胸腺与脾脏中的变化规律基本一致；5.受照后Treg细胞中CD39和CD103的表达具有显著差异,其中CD39+Treg细胞比例增加,单个Treg细胞中CD39的MFI在胸腺中上调而在脾脏中下调；CD103+Treg细胞比例变化在脾脏中先下调后上调,在胸腺中于受照后4d出现一过性上调,单个Treg细胞CD103的MFI在胸腺中下调,而在脾脏中上调；6.胸腺Treg细胞中Bcl-2的MFI变化无统计学意义,而Bax的MFI呈上调趋势,Bax/Bcl-2比值亦上调(t=-3.43,p<0.05)；脾脏中的变化规律相反,Bcl-2的MFI持续上调,而Bax的MFI变化无统计学意义,Bax/Bcl-2比值下调t=2.40,p<0.05)；单个Treg细胞中CD39的MFI变化规律与Bax/Bcl-2比值变化规律一致；7.利用microRNA数据库检索了靶向作用于CD39的microRNAs,检索结果有6个,然后利用real-time PCR进行扩增分析发现miR-31的表达变化与CD39的MFI变化规律基本一致。结论1.不同剂量照射对淋巴细胞及其Treg细胞亚群细胞数的影响不同,其中较高剂量诱导Treg细胞数减少,而低剂量照射诱导其增加；淋巴细胞与Treg细胞亚群之间具有不同的时间响应；2.离体Treg细胞对辐射具有抗性,但辐射可诱导全身照射的Treg细胞凋亡率显著增加,且辐射诱导Treg细胞凋亡率与增殖能力的改变随受照后时间和所处器官的不同而具有不同规律,表明Treg细胞的活性受所处微环境的影响显著。3.Bax和Bcl-2分别在胸腺和脾脏的辐射诱导Treg细胞凋亡过程中发挥主要作用,Bax/Bcl-2比值的改变可以反映Treg细胞的凋亡水平,且Bax和Bcl-2参与的Treg细胞凋亡机制中受CD39的正向调节；4.辐射可诱导FOXP3的表达改变,Treg细胞具有可塑性；同时辐射可诱导Treg细胞表型改变,其中CD39和CD103是辐射诱导Treg细胞表达差异的两个重要表面因子, CD103介导辐射诱导炎性反应中Treg细胞的迁移,而CD39的表达差异则主要参与Treg细胞的抗辐射诱导凋亡；5.CD39的表达水平变化受外在微环境的影响,也有基因水平的调节,其中miR-31对其发挥负向靶向调节作用。