大气污染相关疾病的发生呈逐年上升趋势,可吸入颗粒物(PM₁₀,空气动力学直径≤10μm)作为大气污染物的主要成分,与多种疾病的发生密切相关。然而其相关毒理学资料相对匮乏,亟待我们进行广泛研究。深入了解和研究PM₁₀导致的有害威胁及毒性机制,对于我们阐明PM₁₀的中毒机理以及其毒性预警具有指导作用,也对政府制定环境监测指标及健康风险评价具有重要意义。基于此,本研究开创性地利用本课题组研发的气动雾化给药装置,以小鼠为模型,结合高通量测序技术和生物信息学手段,筛选对PM₁₀毒性响应敏感的分子标记物,并研究PM₁₀导致小鼠多组织损伤的毒性效应和机制。研究结果显示:1.PM₁₀暴露导致小鼠多组织病变不同年龄小鼠（幼年、成年、老年）暴露PM₁₀一定时间（3d,7d,15d）后,HE染色观察肺、肾脏、肝脏、心脏、大脑和睾丸组织的病理变化。结果显示,PM₁₀对幼年小鼠的组织损伤最为严重,因此,后期实验中本研究主要利用幼年鼠为模型进行深入研究。HE结果显示,PM₁₀暴露对肺部损伤最严重,肾脏、肝脏、心脏次之,对大脑和睾丸组织损伤最轻。肺部在暴露处理3d后就发现了炎症细胞的浸润,毛细血管和静脉扩张充血,15d暴露组这些现象更加显著,而且出现了多个病灶。肾脏组织在暴露7d后出现肾小球细胞增多,体积增大的现象。肝脏组织7和15d暴露组出现细胞浑浊肿胀,中央静脉充血及炎症细胞浸润。心脏组织只有在15d暴露组出现轻微血管扩张。大脑组织和睾丸组织在暴露期间均未发生明显病变。2.PM₁₀暴露导致小鼠显著的氧化应激为了进一步确认PM₁₀的毒性效应,本研究依据HE染色结果提示,选择病变明显的肺部组织为对象,研究PM₁₀对其造成的氧化损伤情况。研究结果显示,不同年龄段小鼠在PM₁₀胁迫不同时间后,肺部组织已明显发生氧化应激。PM₁₀暴露3d后已经显著导致肺部组织发生脂质过氧化（MDA）,其中,幼年小鼠脂质过氧化水平最高,但是随时间延长,脂质过氧化水平升高不显著。氧化损伤的另一个分子指标,GSH-Px的活性也显著增加（P<0.05）,相对来说,老年组小鼠GSH-Px的活性更高。3.PM₁₀在转录组水平的毒性机制为了进一步深入研究PM₁₀的毒性机制,本研究以PM₁₀的主要毒性靶器官肺为研究对象,利用高通量测序技术,在转录组水平研究PM₁₀的毒性机制。PM₁₀暴露小鼠7d,发现了1150个差异表达的编码基因,其中723个基因表达上调,427个表达下调,对其m RNA进行GO富集分析发现,PM₁₀暴露后,在生物学过程上,主要影响应激应答、创伤应答、防御应答、炎症响应、免疫系统调节与应答、化学物刺激应答、细胞因子等生物学过程;在细胞组分上,广泛影响细胞表面、胞外空间和基质、溶酶体、细胞质、细胞膜和内质网等多种组分;分子功能上,PM₁₀主要影响了蛋白质、脂质、钙离子、细胞外基质等的结合绑定能力。KEGG富集分析结果显示,PM₁₀主要影响了肺的吞噬体、溶酶体、补体与凝血级联反应和抗原处理与呈递等代谢通路。4.LncRNA的表达及其靶基因富集分析在Lnc RNA表达研究发现中,预测了6571个新型Lnc RNA,本研究中发现了831个Lnc RNA在已有数据库中已有注释。PM₁₀暴露后,共有30个Lnc RNA的表达发生了显著的改变,然后通过Cis和Trans原理预测发现这些差异表达Lnc RNA共有103个靶基因。这些靶基因的GO分析显示,PM₁₀暴露主要影响细胞趋化、趋化因子活性与受体绑定、细胞因子活性、细胞因子受体及G蛋白偶联受体等方面。KEGG代谢通路分析发现,PM₁₀暴露主要影响了小鼠肺组织的细胞因子与细胞因子受体相互作用,趋化因子受体,剪切体及抗原处理与呈递等代谢通路。通过与差异表达编码基因m RNA的富集分析比较发现,Lnc RNA靶基因的GO富集和KEGG富集有很多重叠的地方。如炎症反应及免疫应答等相关过程与代谢通路。这也更加证明了PM₁₀的毒性效应主要涉及应激、炎症、免疫等方面。5.结合qPCR技术筛选PM₁₀的毒性效应分子组学研究对于筛选毒物的效应分子具有独特的优势,本研究在测序数据的基础上,利用qPCR技术,在m RNA、Lnc RNA和circ RNA三种组分中筛选了对PM₁₀暴露敏感的分子作为生物分子指示物。结果显示,9个备选编码基因可以作为PM₁₀暴露后肺部组织的潜在分子标记物,其中Saa3、Mmp12和Kap三个基因对PM₁₀暴露的响应更加敏感,是更为优良的生物标记分子。但对于其他组织来说,Kap和Umod基因的表达与肺组织的响应一样,因此其可以作为肾脏、肝脏、心脏的潜在生物标记分子。Lnc RNA结果显示,肺组织暴露PM₁₀7d的结果与测序结果完全一致。H19和XLOC₃40807的表达显著降低,而Gml2840、RP23-110C17.2、RP24-16A7.7和XLOC₃149476的表达显著上调。其中RP23-110C17.2、RP24-16A7.7更适合作为肺组织对PM₁₀响应的标记物,尤其是早期响应标记物。由于Lnc RNA的表达具有很强的时空表达特异性,因此,PM₁₀暴露后,肾脏、肝脏、心脏中这些Lnc RNA对PM₁₀暴露的响应不同。因此,Lnc RNA并不适合作为通用的分子标记物指示PM₁₀毒性效应。circ RNA研究结果显示,PM₁₀暴露后,并没有显著的差异表达基因,因此circ RNA并不合适用于PM₁₀的毒性效应指示分子。6.PM₁₀暴露导致炎症反应、免疫应答、内质网应激与矿物吸收信号通路发生异常为了进一步研究PM₁₀主要毒性效应及机理,本研究对基于测序结果的信息分析数据进行了m RNA和蛋白表达水平的研究,对于PM₁₀暴露影响显著的信号通路炎症反应、免疫应答、内质网应激与矿物吸收进行深入的研究。结果显示,PM₁₀暴露后,四个受PM₁₀影响显著的信号通路关键分子的表达不同程度的上调。具体来说,PM₁₀暴露后,四种组织中,炎症反应的标志基因CXCL1,CXCL和XCL1在m RNA和蛋白水平均呈现诱导性的上调;免疫应答相关信号通路基因MRC1和MSR1的m RNA和蛋白表达在肺、肾两种组织中明显上调,另一个免疫应答蛋白CD74的表达也呈现类似的表达趋势;PM₁₀对四种组织内质网应激的激活情况也不尽一致,Bip和CHOP基因的蛋白表达水平在PM₁₀暴露后主要在肺、肾、肝三种组织发生明显升高,提示这三种组织发生了明显的内质网应激,而对心脏组织的影响较小;在转录水平,四种组织中Cu2+运输相关基因SLC31A1,Ca2+结合基因S100g的表达在PM₁₀暴露后显著上调;Fe2+相关基因HMOX1只有在肝脏组织中呈现先下降后上升的趋势;细胞外液和电解质平衡调节基因Nppa的表达则受到PM₁₀暴露而被显著抑制（肝脏组织中没有检测到该基因的表达）。在蛋白水平上,PM₁₀暴露后,Cu2+运输相关蛋白SLC31A1和Fe2+相关蛋白HMOX1均出现程度不同的显著上调,这说明PM₁₀暴露后也会显著影响各种矿物离子的转运和吸收。综上所述,本研究表明:PM₁₀经气动雾化法暴露后导致小鼠肺、肾、肝、心等多组织发生病理性损伤;诱导肺组织发生明显的氧化应激,大量m RNA和Lnc RNA差异表达;m RNA和Lnc RNA靶基因的GO和KEGG分析发现PM₁₀的毒性效应主要涉及应激、炎症、免疫等方面;部分显著差异表达的m RNA和Lnc RNA有望作为PM₁₀的毒性效应用于毒性预警,而circ RNA则不适用于PM₁₀的毒性效应分子标志物;炎症反应、免疫应答、内质网应激和矿物吸收信号通路关键信号分子调控的紊乱是PM₁₀引起呼吸对象毒性效应的主要原因。