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慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一种获得性造血干细胞克隆增殖性血液系统恶性肿瘤,由于造血干细胞移植术的开展、针对BCR-ABL的酪氨酸激酶抑制剂的临床应用,慢性粒细胞白血病患者的生存期明显延长,但仍有部分患者在发病后5年内发生急变。急变及加速期CML患者可检测到p53基因突变或缺失,同时发现有中心体数量异常,而且急变期显示更为严重的中心体异常。中心体异常可导致异常有丝分裂、非整倍体的发生和基因组不稳定,已经在人类多种实体瘤和白血病中被检测出。P53信号通路与中心体复制之间存在着密切的关系,缺失或突变所致P53功能失活可以诱导中心体增殖,推测其可能是通过P53的转录激活-依赖性和转录激活-非依赖性途径对中心体增殖的调控。鉴于此,本研究以p53基因突变的白血病K562细胞为模型,探索外源性野生型p53基因表达后,p53信号转导通路对K562细胞中心体异常增殖的影响及可能的机制,以期寻求用野生型p53基因治疗白血病的可能性。实验从两方面进行研究,主要方法如下:1.表达外源性野生型p53基因的白血病K562细胞模型的建立分别将含有野生型p53基因(Ad5wtp53)、突变型p53基因(Ad5mtp53)和绿色荧光蛋白基因(Ad5GFP)的重组腺病毒表达载体在HEK293细胞中反复扩增,病毒滴度测定后与polybrene 4ug/ml共感染K562细胞,以空白K562细胞作对照,经荧光倒置显微镜及流式细胞术检测重组腺病毒载体感染效率,Western blot检测P53蛋白的表达情况。2.重组腺病毒介导的野生型p53基因对K562细胞中心体数量的影响及可能机制间接免疫荧光染色法和激光共聚焦显微镜检测各组细胞内γ-微管蛋白、α-微管蛋白和绿色荧光蛋白的表达,针对中心体γ-微管蛋白的免疫荧光染色来定量计数中心体数量。Western blot检测p53信号转导通路下游效应分子生长阻滞和DNA损伤应答基因Gadd45a(growth arrest and DNA-damage-inducible, alpha),BubR1(Bub 1 related)和Aurora A蛋白的表达情况,以进一步探讨重组腺病毒介导的野生型p53基因对K562细胞中心体数量影响的可能机制。通过以上实验,获得如下主要结果: 1.三种重组腺病毒载体Ad5wtp53、Ad5mtp53和Ad5GFP组分别感染K562细胞24h、48h和72h时,发现随感染时间延长,绿色荧光蛋白的表达(即重组腺病毒感染效率)逐渐升高,72h时可见60%以上的细胞表达绿色荧光蛋白。Ad5wtp53、Ad5mtp53感染K562细胞72h后P53表达不同程度的上调,而Ad5GFP组无明显改变。与空白对照细胞相比,目的条带与内参α-tubulin的光密度比值Ad5wtp53组上调P53蛋白2.31倍,Ad5mtp53组上调P53蛋白5.46倍,差异均有统计学意义(P<0.05)。2.Ad5wtp53感染K562细胞72h后含异常中心体(n>2)的细胞比例降至(0.38±0.02)%,与空白对照组(0.71±0.14)%相比差异显著(P<0.05),但是不能恢复到正常对照组(0.08±0.01)%的水平(P>0.05)。而处理72h后Ad5mtp53、Ad5GFP组异常中心体数量(n>2)的细胞比例分别为(0.75±0.15)%和(0.69±0.09)%,与空白对照组相比无明显改变(P均>0.05)。K562细胞感染Ad5wtp53 72h后,与空白对照组相比Gadd45a、BubR1蛋白表达分别上调93%,88%(p均<0.05);K562细胞感染Ad5wtp53 48h、72h后Aurora-A蛋白量随感染时间延长逐步下降,与对照组相比分别下调49%,56%(p均<0.05);其他各组表达差异无统计学意义。通过上述实验及结果可以得出如下结论:重组腺病毒介导的野生型p53基因能够在白血病K562细胞中持续表达;野生型P53蛋白能够降低K562细胞中心体数量。野生型P53蛋白可能通过转录激活-依赖途径上调Gadd45a、BubR1表达以及转录激活-非依赖途径使Aurora A的表达下降来抑制K562细胞中心体的过度复制。