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地球上绝大多数生物体保守地利用标准的密码子编码20种天然氨基酸。虽然在少数细菌和真核生物细胞中出现少数密码子的自然变异,但在脊椎动物体内人工扩充遗传密码子来实现基因编码非天然氨基酸(Uaas)仍具有巨大挑战。扩充遗传密码子来实现基因编码Uaas是通过将氨酰tRNA合成酶与抑制子tRNA正交对(aaRSs/tRNAcuA)引入到活细胞内,解码“空白密码子”(一般指终止密码子或移码的密码子)来实现的。该技术是在大肠杆菌中建立起来的,随后逐步应用在酵母细胞、哺乳动物细胞以及构建密码子扩充的转基因非脊椎动物如线虫、果蝇,并在其体内实现Uaas的点特异整合。虽然,向小鼠的细胞与组织中瞬时引入aaRSs/tRNAcuA能在其内实现Uaas的点特异整合,但能否构建可遗传的遗传密码子扩充的转基因脊椎动物仍然是未知的。同时,脊椎动物的生物复杂性能否允许用于遗传密码子扩充的遗传材料的引入、维持及稳定传递也是未知的。我们首先决定将AzFRS/tRNACUA正交对基因整合到小鼠基因组上,该正交对能使琥珀密码子(UAG)编码非天然氨基酸,4-叠氮基-苯丙氨酸(AzF)。优化的RS(tRNA)4×质粒经线性化被直接注射到小鼠受精卵后,成功获得RS(tRNA)4×转基因小鼠,且RS(tRNA)4×基因可有效传递给下一代。接着,以Gapdh基因作为内参,用qPCR技术检测到F2代转基因小鼠中RS(tRNA)4×基因的拷贝数是15个。此外,利用免疫印迹实验技术在F2代转基因小鼠主要组织中均检测到AzFRS的表达。以上结果说明,RS(tRNA)4×基因已经被整合到小鼠基因组上且能稳定遗传。接着,我们评估了 RS(tRNA)4×转基因的整合对活体小鼠的潜在影响。通过HE染色分析,RS(tRNA)4×小鼠与野生型小鼠在主要组织的形态上均没有显著差异。然后,利用RNAseq分析了肝脏组织中基因表达情况。结果表明,与野生型小鼠相比,在转基因小鼠肝脏中只有少数基因的表达发生变化。为了检测这些基因表达变化是否对肝脏功能有影响,我们检测了肝脏代谢相关血液生化指标,转基因小鼠与野生型小鼠之间并没有显著差异。此外,我们还给转基因小鼠饲喂含或不含AzF的风味水,也没有发现两组小鼠的血液生化指标有差异。以上结果表明,RS(tRNA)4×基因整合到小鼠基因组,并未对其造成显著生理损伤。为了评估整合到小鼠基因组上的AzFRS/tRNAcuA正交对基因的功能,我们在成年转基因小鼠来源的原代细胞中进行了 AzF整合的实验。利用携带双荧光报告分子EGFP-amb-mCherry的慢病毒分别感染这些原代细胞,当培养基中添加AzF时,我们在分化的神经球细胞和骨髓细胞中均检测到了琥珀密码子的通读,但在成纤维细胞中并未检测到。接着,将额外的tRNACUA与EGFP-amb-mCherry共转染到成纤维细胞中,实现了 AzF的整合,说明AzFRS是有功能的而tRNACUA在成纤维细胞中表达受限制。以上结果表明,转基因小鼠的原代细胞中能够成功表达有功能的AzFRS/tRNACUA正交对。该正交对能使琥珀密码子编码AzF,实现AzF定点整合到报告分子中,但AzF的整合是具有细胞类型的依赖性,且部分受tRNACUA表达量的影响。我们也尝试扩充斑马鱼的遗传密码子。将一个全身普遍表达AzFRS/tRNACUA的质粒与To12转座子酶的mRNA注射到1细胞期的斑马鱼受精卵内,我们成功得到RS(tRNA)4×转基因斑马鱼。通过免疫印迹实验,检测到在F2代转基因斑马鱼的胚胎和成体鱼鳍组织中均有AzFRS的表达,这表明了转基因已成功稳定整合到斑马鱼基因组上。为了评定AzF能否在斑马鱼的体内整合,报告分子mCherry-eGFP(Y145amb)的mRNA被注射到1细胞期的F2代转基因斑马鱼胚胎中,然后将胚胎孵育在含2.5mMAzF的水中,在受精24h后(24hpf),我们观察到胞核内含绿色荧光信号的细胞逐渐增多,表明琥珀密码子在斑马鱼体内已被通读。综上所述,我们首次报道成功构建了遗传密码子扩充的转基因小鼠和转基因斑马鱼。aaRSs/tRNACUA正交对能分别在小鼠活体外和斑马鱼体内使琥珀密码子编码Uaas。这样能基因编码Uaas的转基因脊椎动物,对于体内研究生理和病理过程以及产生新的特定功能将是非常重要的。