禽流感(AvianInfluenza，AI)是由A型流感病毒引起的一种禽类的烈性传染病。自1878年意大利首先发现以来，该病目前已经在世界范围内爆发和流行。在16个HA亚型和9个NA亚型中，H5N1高致病性禽流感病毒(H5N1HPAIV)由于能感染人并可能引起下一次的流感大流行而受到人们特别的关注，尤其是香港1997年和东南亚2003-2004年出现的H5N1亚型禽流感病毒直接感染人并致人死亡的事件，引起了世人的震惊和关注。据WHO的统计，截至2008年4月30日，该病已造成全球382人感染，241人死亡。我国自1996年首次报道分离到H5N1亚型高致病性禽流感病毒之后，其流行一直呈上升趋势。从2003年首次出现人感染禽流感的病例，我国已累计病例30例，其中20人死亡。目前，世界上已经有50多个国家和地区出现了HPAI，HPAI已经成为制约全球经济发展和威胁人类和动物健康的重大传染病。面对禽流感的流行态势，快速诊断是实现疫情预警、监控的有效手段，可为及时控制疫情赢得宝贵时间。一些常用的方法如病毒分离、中和试验、PT-PCR等虽然各有优点，但且具有耗费时间长、技术要求高、不适合临床现场快速检测等不足。鉴于此，本论文开展了禽流感病毒(通用型和H5亚型)快速诊断技术的研究以及NS1dsRNA结合功能域阻断多肽的研究。主要研究内容和结果如下： 1.禽流感病毒H5亚型乳胶凝集检测方法的建立和临床应用应用羧化乳胶偶联蛋白质的技术，以水溶性碳化二亚胺为介质，将抗H5亚型禽流感病毒单克隆偶联到羧化乳胶表面，建立了禽流感病毒H5亚型乳胶凝集快速检测方法。该方法可以从鸡胚尿囊液、内脏组织、气管拭子和泄殖腔拭子中快速检测出H5亚型禽流感病毒。与1:64倍稀释的H5N1鸡胚尿囊液呈阳性反应，而与其它亚型的禽流感病毒和禽的其它呼吸道病毒均不反应，具有较好的敏感性和特异性。建立的乳胶凝集方法可以从H5N1感染24小时到30天的鸡的气管拭子中检测出H5N1禽流感病毒，最高检出率为79.2％，最低为45.5％。内脏组织的检出率相对较高，肺脏的检出率达到96.7％，肝脏、脾脏、肾脏和脑组织的检出率也在90％以上，心脏和泄殖腔的检出率较低，为41.7％和26.8％。828份临床样本同时用乳胶凝集试验和病毒分离检测，以比较乳胶凝集试验的敏感性和特异性。和病毒分离相比，乳胶凝集的敏感性为92.0％，特异性为98.9％，阳性符合率为99.1％，阴性符合率为90.1％。两种方法的总符合率为94.9％。另外，用乳胶凝集试验、病毒分离、韩国H5AIVAgTestKit和H5AIVrealtimeRT-PCRTestKit同时检测90份临床样本中，结果显示乳胶凝集和病毒分离的符合率为94.4％，和韩国H5AIVAgTestKit的符合率为96.7％，和H5AIVrealtimeRT-PCRTestKit的符合率为87.8％。致敏乳胶在37℃可以保存3天，4℃可以保存6个月。禽流感病毒H5亚型乳胶凝集检测方法快速简便，易于操作，不需要特殊的仪器和实验技能，价格低廉，适合于现场使用，将在我国高致病力H5N1亚型禽流感防制中发挥积极作用。 2.禽流感病毒乳胶凝集检测方法的建立和临床应用将亲和层析的兔抗禽流感NP蛋白多克隆抗体偶联到羧化乳胶表面，建立了禽流感病毒乳胶凝集快速检测方法。该方法和15个亚型的禽流感病毒均能反应，和禽的其它呼吸道病毒不反应，具有较好的敏感性和特异性。对感染H5N1鸡内脏组织进行检测，肺脏的检出率达到96.7％，肝脏、脾脏、肾脏和脑组织的检出率在90％左右，心脏和泄殖腔的检出率较低，为41.7％和26.8％。对感染H9N2、H4N6、H1N1和H3N2鸡内脏组织进行检测，肺脏的检出率在90％左右，肝脏、脾脏、肾脏和脑组织的检出率在83％左右，心脏和泄殖腔的检出率较低，在20％左右。678份临床样本同时用乳胶凝集和病毒分离检测，以比较乳胶凝集的敏感性和特异性。和病毒分离相比，乳胶凝集的敏感性为94.4％，特异性为100％，阳性符合率为94.4％，阴性符合率为94.1％。两种方法的总符合率为97.1％。另外，用LAT、病毒分离、AIVAgTestKit(AnimalGenetics，Inc，Korea)同时检测123份临床样本中，结果显示乳胶凝集和病毒分离的符合率为96.7％，和AIVAgTestKit的符合率为97.5％。致敏乳胶在37℃可以保存3天，4℃可以保存6个月。 3.禽流感病毒H5亚型胶体金试纸条的研制及临床应用本试验应用胶体金标记技术(immunogoldlabelingtechnique)，根据免疫层析原理，用胶体金标记抗H5亚型禽流感病毒单克隆抗体(1C4)，在硝酸纤维膜上分别包被抗H5亚型禽流感病毒单克隆抗体(1D4、lE12、2E11、402、4C12和5E12)和羊抗鼠二抗作为检测线和对照线，研制了一种禽流感病毒H5亚型快速检测试纸条。该试纸条可以从鸡胚尿囊液、内脏组织、泄殖腔拭子中快速检测出H5亚型禽流感病毒。与1:256倍稀释的H5N1鸡胚尿囊液呈阳性反应，而与其它亚型的禽流感病毒和禽的其它呼吸道病毒均不反应，具有较好的敏感性和特异性。试纸条可以从H5N1感染的内脏组织中检测到相应的病毒，肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和脑组织的检出率最高，达到100％，其次是心脏和胰脏，为80％，泄殖腔的检出率最低，为26.8％。252份临床样本同时用试纸条和病毒分离检测，以比较试纸条的敏感性和特异性。和病毒分离相比，试纸条的敏感性为89.4％，特异性为100％，阳性符合率为100％，阴性符合率为76.2％。两者的总符合率为92.1％。和韩国H5AIVAgTestKit相比，本试纸条的敏感性要比韩国试纸条的敏感性高16倍。122份临床组织样品的检测结果显示，两者的总符合率为82.0％。用试纸条和RT—PCR方法同时检测126份临床样品，两者的符合率为92.9％。试纸条在37℃可以保存12天，4℃可以保存12个月。该试纸条具有检测快速和使用方便等优点，可以适用于临床样品的大量检测，为H5N1高致病性禽流感的防控提供了有效的工具。 4.禽流感病毒NS1蛋白dsRNA结合区(1～73氨基酸)的表达及阻断多肽的研究将NS1蛋白dsRNA结合区(1～73氨基酸)的基因克隆于PGEX-KG载体中并在大肠杆菌BL21中表达，诱导上清经过SDS-PAGE检测，证实NS1蛋白1～73氨基酸在大肠杆菌中获得了表达，融合蛋白的大小约38KD。表达的蛋白先经GST融合蛋白纯化柱纯化，再用凝血酶(Thrombin)切割掉GST蛋白，最后经6xHis标签纯化得到NS11～73氨基酸的蛋白，大小约12KD。以纯化的蛋白作为靶蛋白，从十二肽库中筛选与其特异性结合的多肽。经过3轮筛选，并经过ELISA分析，得到14个阳性噬菌体克隆。同时用H5N1禽流感病毒感染MDCK细胞，24小时后回收细胞并用ProFoundLysisBuffer裂解；H9N2禽流感病毒感染MDCK细胞，36小时后回收细胞并用ProFoundLysisBuffer裂解；感染病毒的细胞裂解液直接包被ELISA板，检测与14个噬菌体展示肽的反应性。同时设以下对照：MDCK正常细胞裂解液对照、Hep2正常细胞裂解液对照、BL21大肠杆菌全菌裂解液对照、BSA对照、凝血酶Thrombin对照。从14个噬菌体中筛选出三个噬菌体，该三个噬菌体与H5N1、H9N2禽流感病毒感染MDCK细胞裂解液有较强的阳性反应，与其它对照均不反应，具有与禽流感病毒感染的细胞中的NS1蛋白特异性结合的能力。本研究从噬菌体展示随机肽库中筛选出的特异性结合的阻断多肽，为进一步研究禽流感病毒致病机理及抗流感病毒药物奠定了基础。