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研究背景及目的:重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis,SAP）是一种与全身炎症反应综合征（systematic inflammatory response syndrome,SIRS）及多器官功能衰竭（multiple organ failure,MOF）相关的炎症性疾病,死亡率高达40%。肠屏障功能障碍在其发生发展中其起重要作用,但是发生机制尚不清楚。肠屏障功能障碍继发细菌和内毒素（lipopolysaccharide,LPS）易位在SIRS及MOF发生发展中起重要作用。此外,SAP的腹水（ascitic fluid,AF）中含有大量胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、炎症细胞因子、细菌和它们的代谢产物内毒素等,这些成分加重胰腺及周围组织的损伤,也破坏肠屏障功能,促使SIRS和MOF的发生。SAP时全身许多系统和脏器存在Toll样受体（Toll like receptors,TLRs）信号通路过度激活,且与肠屏障功能障碍密切相关。TLRs家族包括多条信号通路,TLR4/NF-κB其中研究最为透彻的一条。TLR4主要识别LPS,从而启动信号转导介导炎症反应。课题组早期研究发现SAP腹水可以激活巨噬细胞内TLRs信号通路,介导多种炎症介质释放。那么,SAP患者的腹水和LPS是否会激活肠上皮细胞的TLRs信号通路并引起肠屏障功能障碍?目前尚不清楚。为此,本文研究了SAP患者的腹水和LPS对肠上皮细胞屏障功能的影响及其可能机制进行了初步探讨。方法:一、LPS及SAP腹水对肠上皮细胞屏障功能的影响1.构建Caco-2和IEC-6单层肠上皮细胞屏障模型;2.LPS或SAP腹水处理单层肠上皮细胞屏障模型48小时;（1）LPS处理分组:（1）对照组,（2）LPS组（LPS浓度100μg/ml）;（2）SAP腹水处理分组:（1）对照组,（2）胆源型腹水组（腹水浓度10%）,（3）高脂型腹水组（腹水浓度10%）,（4）混合腹水组（胆源型+高脂型）（腹水浓度10%）;3.检测指标:（1）跨膜电阻:LPS或SAP腹水处理后第1、3、6、12、24、48小时用细胞电阻仪分别测量肠上皮细胞屏障模型跨膜电阻值;（2）荧光黄透过率:LPS或SAP腹水处理第48小时检测,检测方法:在肠上皮细胞屏障模型上层加入20μg/ml荧光黄溶液,计算单位时间内荧光黄从上层进入到下层的量;（3）肠上皮细胞间紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-1的表达;二、LPS及SAP腹水对肠上皮细胞内TLRs信号通路的影响不同浓度LPS或SAP腹水处理Caco-2细胞和IEC-6细胞,观察TLRs信号通路相关分子表达水平变化。1.实验分组:（1）LPS处理:（1）对照组,（2）不同浓度LPS组:0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml;（2）SAP腹水处理:（1）对照组,（2）不同浓度胆源型腹水组:1.25%、2.5%、5%、10%、20%,（3）不同浓度高脂腹水组:1.25%、2.5%、5%、10%、20%;2.检测指标:（1）荧光定量PCR检测各组TLRs信号通路相关分子My D88、IRAK-1、TRAF6 m RNA表达;（2）Western Blot检测各组TLRs信号通路相关分子TLR4、My D88、IRAK-1、TRAF6、NF-κB p65、IKB-α表达;三、LPS及SAP腹水对肠上皮细胞内SIGIRR表达的影响1.实验分组:（1）对照组,（2）LPS组,（3）胆源型腹水组,（4）高脂型腹水组;2.检测指标:（1）荧光定量PCR检测各组细胞内IL-37、IL-18Rα、SIGIRR m RNA水平;（2）Western Blot检测各组细胞内SIGIRR蛋白水平;四、SIGIRR对肠上皮细胞内TLRs信号通路的调控1.SIGIRR敲减Caco-2细胞株构建与验证构建分别含SIGIRR-RNAi（si-1）、SIGIRR-RNAi（si-2）和SIGIRR-RNAi（si-3）的三个慢病毒载体并进行慢病毒包装（以上实验委托上海吉凯公司构建）。以不同的MOI（30、50、70、90）感染Caco-2,确定最佳感染效率的MOI,通过嘌呤霉素药筛SIGIRR敲减的稳转细胞株,并通过q-PCR和Western Blot检测SIGIRR m RNA和蛋白的表达,验证敲减效果。2.SIGIRR对Caco-2细胞内TLRs信号通路的影响（1）实验分组:（1）空白组:阴性对照细胞SIGIRR敲减细胞（2）LPS组:阴性对照细胞+LPS SIGIRR敲减细胞+LPS（3）胆源型腹水组:阴性对照细胞+胆源型腹水SIGIRR敲减细胞+胆源型腹水（4）高脂型腹水组:阴性对照细胞+高脂型腹水SIGIRR敲减细胞+高脂型腹水（2）检测指标:荧光定量PCR检测各组TLRs信号通路相关分子TRAF6、IRAK-1 m RNA表达。结果:一、LPS及SAP腹水对肠上皮细胞屏障功能的影响1.LPS及SAP腹水对肠上皮细胞屏障模型电阻值影响（1）LPS处理后连续测定Caco-2和IEC-6细胞屏障模型电阻值变化:Caco-2细胞屏障模型在LPS处理第1小时电阻值就出现明显下降（P<0.05）,在48小时内随着时间的延长电阻值持续降低且具有统计学差异（P<0.05）;IEC-6细胞屏障模型在LPS处理第3小时出现下降,但无统计学差异（P>0.05）,在第6小时电阻值明显降低且具有统计学差异（P<0.01）,随处理时间延长不断降低（P<0.05）。（2）SAP腹水处理后连续测定Caco-2细胞屏障模型电阻值变化:（1）胆源型腹水处理:在处理第1小时电阻值就出现明显降低（P<0.05）,48小时内呈现不断下降趋势（P<0.05）;（2）高脂型腹水处理:从第3小时开始电阻值下降具有统计学差异（P<0.01）,48小时内呈现不断下降趋势（P<0.01）;（3）混合腹水处理:从第3小时开始电阻值下降具有统计学差异（P<0.05）,48小时内呈现不断下降趋势（P<0.01）;（4）不同腹水对比:在处理1小时和48小时二者电阻值降低无明显差异（P>0.05）,3小时、6小时、12小时、24小时高脂型腹水组TEER降低较胆源型腹水组明显（P<0.05）,而MIX-AF介于B-AF与HTG-AF之间。2.LPS及SAP腹水对肠上皮细胞屏障模型荧光黄透过率影响（1）LPS处理:LPS处理组显著提高Caco-2和IEC-6细胞屏障模型荧光黄的通透性显著高于对照组（P<0.05,P<0.01）;（2）SAP腹水处理:无论是胆源型腹水、高脂型腹水还是二者的混合腹水处理Caco-2细胞屏障模型荧光黄的通透性均显著高于对照组（P<0.05）;同时,高脂型腹水处理对Caco-2细胞屏障模型荧光黄的通透性显著高于胆源型腹水处理组（P<0.05）。3.LPS及SAP腹水对肠上皮细胞间紧密连接蛋白的影响（1）Western Blot结果显示,紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1的表达在LPS处理组显著低于对照对照组（P<0.001）;在胆源腹水或高脂型腹水处理后,也显著低于对照组（P<0.001）;且高脂型腹水处理组ZO-1表达显著低于胆源型腹水处理组（P<0.05）,而Occludin、Claudin-1无显著差异（p>0.05）;（2）细胞免疫荧光结果显示,ZO-1表达在LPS处理组显著低于对照组（P<0.001）;胆源型腹水和高脂型腹水处理组显著低于胆源型腹水处理组（P<0.05）,且高脂型腹水处理组显著低于胆源型腹水处理组（P<0.05）;二、LPS及SAP腹水对肠上皮细胞内TLRs信号通路的影响1.LPS对肠上皮细胞内TLRs信号通路的影响:（1）对Caco-2细胞的影响:（1）在m RNA水平,TRAF6和IRAK-1表达在LPS处理组显著高于对照组（P<0.05）,My D88表达无显著差异（P>0.05）。（2）在蛋白水平,TLR4、TRAF6表达在LPS处理组显著高于对照组（p<0.05）,My D88表达无显著差异（P>0.05）,IKB-α表达在LPS处理组显著低于对照组（p<0.05）。（2）对IEC-6细胞的影响:（1）在m RNA水平,My D88、TRAF6、IRAK-1的表达在LPS处理组显著高于对照组（p<0.05）;（2）在蛋白水平,TLR4、My D88的表达在LPS处理组显著高于对照组（p<0.05）。2.SAP腹水对肠上皮细胞内TLRs信号通路的影响:（1）对Caco-2细胞的影响:（1）在m RNA水平,My D88、TRAF6和IRAK-1的表达在胆源型腹水和高脂型腹水处理组均显著高于对照组（P<0.05）;（2）在蛋白水平,TLR4、My D88、TRAF6和p-NF-κB p65的表达在胆源型腹水和高脂型腹水处理组均显著高于对照组（p<0.05）;（2）对IEC-6细胞的影响:（1）在m RNA水平,My D88和TRAF6的表达在胆源型腹水处理组显著高于对照组（P<0.05）,IRAK-1的表达无显著差异（P>0.05）;My D88、TRAF6和IRAK-1的表达在高脂型腹水处理组显著高于对照组（P<0.05）;（2）在蛋白水平,TLR4和My D88的表达在胆源型腹水和高脂型腹水处理组均显著高于对照组（p<0.05）。三、LPS及SAP腹水对肠上皮细胞内SIGIRR水平的影响1.LPS及SAP腹水对肠上皮细胞内SIGIRR的上游分子IL-37和IL-18Rα表达的影响:IL-37 m RNA表达在LPS和胆源型腹水处理组均显著低于对照组（p<0.001）,IL-18Rαm RNA的表达在高脂型腹水处理组均显著低于对照组（p<0.05）。2.LPS及SAP腹水对肠上皮细胞内SIGIRR m RNA表达的影响:SIGIRR的表达在高脂型腹水处理组显著低于对照组（p<0.01）,而LPS或胆源型腹水处理组无显著差异（P>0.05）。3.LPS及SAP腹水对肠上皮细胞内SIGIRR蛋白表达的影响:糖基化SIGIRR的表达在LPS、胆源型腹水或高脂型腹水处理组均显著低于对照组（p<0.05）;非糖基化SIGIRR表达在胆源型腹水处理组显著低于对照组（p<0.05）,而在高脂型腹水处理组显著高于对照组（p<0.001）。四、SIGIRR对肠上皮细胞内TLRs信号通路的调控1.SIGIRRlowCaco-2细胞株构建与验证（1）感染慢病毒MOI=90时感染效率在90%以上,是合适的感染浓度;（2）荧光定量PCR和Western Blot结果显示,三个靶点均有SIGIRR敲减效果,且靶点3敲减效果最好;2.SIGIRR对Caco-2细胞内TLRs信号通路的影响IRAK-1 m RNA表达在SIGIRRlowCaco-2显著高于NC-Caco-2（P<0.05）,TRAF6 m RNA表达在二组间无显著差异（P>0.05）;LPS或胆源型腹水处理后,IRAK-1表达在SIGIRRlowCaco-2显著高于NC-Caco-2（P<0.05）,高脂型腹水处理后IRAK-1表达在二者间无显著差异（P>0.05）。LPS、胆源型腹水和高脂型腹水处理后,TRAF6表达在SIGIRRlowCaco-2均显著高于NC-Caco-2（p<0.05）。结论:1.LPS与SAP腹水均可导致肠上皮细胞屏障功能障碍,其中高甘油三酯血症性SAP腹水较胆源性SAP腹水毒性更强。2.肠上皮细胞内TLRs信号通路过度激活可能是LPS和SAP腹水破坏肠上皮细胞屏障功能的机制之一。3.肠上皮细胞内TLRs信号过度激活可能与其负性调控因子SIGIRR被抑制有关。