铜离子是人体所必需的微量元素,在体内发挥重要作用,但是过量铜离子会产生大量反应性氧自由基离子(ROS),造成细胞的氧化性损伤,导致人类各种疾病的发生,肝豆状核变性(Wilson disease)是常见的铜离子代谢缺陷性疾病。但近年来的研究发现铜离子毒性还与阿尔茨海默氏症,动脉粥样硬化等的发生紧密相关。许多与疾病直接相关的蛋白如微管相关蛋白Tau,淀粉样前体蛋白APP,软病毒蛋白Prion都是铜离子结合蛋白,这些蛋白与铜离子的相互作用是导致疾病发生的重要因素之一。因此研究潜在的铜离子相关基因及其功能,将有助于揭示铜在人类疾病中的作用机制。人类的CUTA(copper tolerance protein A又名cation tolerance protein A)蛋白是CutA1同源蛋白中的一员,此类同源蛋白多数具有铜离子结合能力,并且大肠杆菌中的CutA1蛋白可能参与了细菌对铜的容忍性。CUTA蛋白与大肠杆菌CutA1蛋白的同源性提示我们CUTA的功能可能与铜离子平衡相关,本文对人类CUTA基因的表达,蛋白性质,以及与铜离子的相关性等方面进行了初步的探讨。我们发现CUTA在人类的18种组织中广泛表达,在肝脏和前列腺中有较高水平的表达。CUTA蛋白集中分布在细胞核的周围,大部分能与线粒体染料共定位,是一种潜在的线粒体蛋白,DSG(disuccinimidvlglutarate)交联试验显示,CUTA蛋白以三聚体的形式存在于真核细胞中。随后,我们对CUTA蛋白与铜离子的相关性进行了深入的探讨,发现CUTA蛋白与铜离子的代谢平衡紧密相关,首先,CUTA蛋白能够结合多种二价金属离子,但它对二价铜离子的结合能力最强;其次,CUTA的表达受铜离子浓度的影响,CUTA蛋白的表达量随细胞外铜离子浓度的增高而增多;最后,CUTA超量表达时,影响了细胞对铜离子毒性的敏感性,使细胞对高浓度铜离子的毒性变得更为敏感,进一步的分析表明CUTA促进了铜离子对细胞增殖的抑制作用,增强了铜离子对细胞凋亡的诱导作用,从而使细胞对铜离子毒性更为敏感。在研究过程中,我们还通过免疫新西兰大白兔的方法制备纯化了CUTA特异性的多克隆抗体,并用此抗体检测了CUTA蛋白在癌症细胞株及肝癌和癌旁组织中的表达。发现CUTA蛋白的表达量与肝癌的发生无明显的相关性,但是在不同的肝癌样本中,CUTA蛋白有不同的上下调表达,这提示我们CUTA可作为肝癌分子分型的候选基因。此外,本文还对本实验室筛选到的一个肝癌中显著下调表达的基因-泛素化连接酶RLIM,在肝癌发生发展中的作用展开了研究,我们依次检验了RLIM的表达对肝癌细胞的克隆形成率,增殖速率和移植瘤生长速度的影响。结果表明:1.RLIM的表达显著降低了肝癌细胞的独立生存能力,抑制了肝癌细胞的克隆形成率,RLIM转染的SK-Hep1细胞的克隆形成率只有对照组克隆形成率的25%;2.RLIM的表达显著抑制了肝癌细胞的增殖速度,比较RLIM稳定转染的SK-Hep1细胞株和对照细胞株的增殖曲线,发现RLIM稳定转染的SK-Hep1细胞的增殖速度显著慢于对照细胞的增殖速度。3.RLIM的表达抑制了肝癌细胞移植瘤的生长速度,将RLIM稳定转染的细胞和对照细胞分别接种于裸鼠,检测肝癌细胞移植瘤的生长速度,发现RLIM稳定转染的细胞株的移植瘤,其生长速度显著慢于对照组细胞的移植瘤,并且最终形成的肿瘤的大小和重量均小于对照组。这些结果暗示了RLIM是一个新的潜在的肝癌抑制基因。综上所述,本文通过对CUTA的组织表达谱,蛋白的亚细胞定位和多聚体构象的分析检测,发现并初步证明了CUTA是一个广谱表达的线粒体蛋白,具有三聚体构象,在对CUTA的功能研究中,我们发现CUTA的功能与铜离子紧密相关,CUTA蛋白能够结合铜离子,CUTA的表达受铜离子浓度的影响,CUTA超量表达能够影响细胞对铜离子毒性的敏感性,因此,我们推测CUTA是人体内的一个铜离子相关蛋白,其功能可能与铜离子对细胞的毒性作用有关。此外,对泛素化连接酶RLIM在肝癌发生发展中的作用的研究显示,RLIM的表达不仅对肝癌细胞的克隆形成和增殖速度具有抑制作用,而且对肝癌细胞移植瘤的生长具有抑制作用,因此我们推测RLIM是一个潜在的肝癌抑制基因。