大肠癌化疗失败的主要原因是肿瘤细胞对分子结构不同、作用机制各异的抗肿瘤药物产生交叉耐药，即多药耐药性(MDR)。对MDR机制的研究，可对肿瘤耐药的逆转提供实验依据。本实验研究目的：①通过阿霉素浓度递增法诱导大肠癌LoVo细胞株产生多药抗性，建立体外耐药模型，观察在阿霉素诱导不同时间段多药耐药相关基因的表达水平，明确可能参与的耐药机制；②探讨耐药细胞表型变化与耐药的关系；③研究PKC对MDR的调控机制。 一、体外耐药模型的建立 采用长期阿霉素(ADR)浓度递增法诱导LoVo细胞，ADR浓度从最初的0.04μg/ml增至1.0μg/ml，历经8个月、连续传代55次，建立了人大肠癌耐药模型LoVo/Adr细胞株。经MTT法鉴定该细胞株具有多药耐药性，其对阿霉素、长春新碱、丝裂霉素、环磷酰胺的耐药倍数分别是61倍、14倍、3倍、9倍，对5-Fu不耐药。为探讨获得MDR的耐药机制，采用RT-PCR法动态观察MDR产生过程中耐药相关基因mdr1、MRP、GST-π及TopeⅡ α mRNA水平的变化。研究表明：亲本LoVo细胞不表达mdr1，随着ADR的诱导mdr1mRNA水平逐渐增高；GST-π mRNA仅在诱导初期显著增高：TopoⅡ α mRNA水平始终无显著变化；未测到MRP的表达。免疫组化观察有显著变化基因的蛋白水平表达，结果表明：mdr1基因的表达产物P-gp在LoVo/Adr细胞中为强阳性，LoVo细胞为阴性；LoVo/Adr细胞GST-π蛋白表达显著高于LoVo细胞。进一步采用1氯-2,4-二硝基苯法对两组细胞的GST活性进行比较，发现LoVo/Adr细胞GST活性与LoVo细胞相比无显著差异。上述结果表明，本实验成功构建了一个表达MDR表型的LoVo/Adr细胞株，其耐药机制主要与mdr1和GST-π基因介导有关，与TopoⅡ α和MRP基因无关。 二、LoVOIAdr细胞表型变化与耐药的夫系采用光学显微镜、扫描电镜观察细胞形态变化，发现与L。Vo细胞相比，LOVo／Adr细胞形态多不规则，细胞大小不一致，体积显著增大。通过连续细胞计数绘制其生长曲线及计算倍增时间，得知 L。VO／Adr细胞生长速度显著减慢，其倍增时间为33．58小时，而L。Vo细胞的倍增时间为20刀9小时，倍增时间延长l．7倍。流式细胞术测定细胞周期分布结果表明：与L。Vo细胞相比，L。Vo／Adf细胞GI期细胞显著增多，而S期细胞显著减少。利用ADR固有的荧光采用流式细胞术检测其摄入功能，研究显示：LoVo／Adr细胞内ADR摄入量为2刀4士0．70，L。Vo细胞为3．99土1．87（P＜0刀1）；加入钙桔抗剂维拉帕米（VP）后，LoVo／Adr细胞对ADR的蓄积能力增强，ADR含量升高到2．67土1．13（Prto刀1）。在荧光显微镜下可观察到ADR能迅速进入LoVo细胞内，30min即可达到平衡；而进入LoVo／Adr细胞的速度明显减慢，lh才达到平衡。在 L。Vo细胞中，ADR集中分布在的核区，胞浆少，加用VP后，荧光强度及分布无明显变化；而在LoVo／Adr细胞中，核区荧光显著减弱，而胞浆荧光相对增多，VP可使荧光分布基本恢复到敏感细胞状。激光共聚焦显微镜检测细胞内CaZ＼pH值结果表明：LoVo／Adr细胞内C4”浓度显著高于LoVo细胞（P＜0．01人 加用VP后，虽两株细胞内 ＊J均有轻度减低，但均无显著性差异（P＞0刀5hLoVo／Adr及LoVo细胞胞浆SNAFL－。alcein－AM荧光强度分别为1528刀3土309．84、889．sl土170．43（尸wto ＊1），说明LoVo／Adr细胞胞浆pH值显著高于L。VO细胞。上述结果提示，L。Vo／Adr细胞不仅摄入ADR量减少，而且药物分布异常，这种异常分布可能与细胞内pH值增高有关，在L。Vo／Adr细胞中叨“浓度明显增高，但与耐药机制无关。 5、PKC与MDR的关系采用HP掺入法测定PKC活性的结果表明，LOVo／Adr细胞胞膜、胞浆的PKC活性与L。Vo细胞相应的组分相比，没有显著性差异（P＞0刀5）。PKC激动剂佛波脂（PMA）对L。Vo和LoVo／Adr细胞PKC活性调节的趋势是一致的：细胞经PMA处理后，胞浆PKC在smin内迅速下降，到Zh时已处于很低的水平；胞膜PKC在smin后逐渐升高，至30min达高峰后开始下降，到24h时，胞膜和胞浆几乎均测不到PKC活性。同时，发现LoVo／Adr细胞接受PMA刺激后， －4－ PKC活性增高幅度显著高于L。Vo细胞。PKC抑制剂十字抱碱（SP）可 显著抑制两组细胞各组分的PKC活性。进一步采用Western blot法检测 PKC亚型表达，研究结果显示：在LoVO／Adr细胞中，PKC．a主要分布 在胞膜中，且显著高于L。Vo细胞；PKC。在两组细胞中表达没有显著 差异，且浆组分和膜组分含量亦无显著差异；可检测到微量的PKC．0， 未检测到PKC－v。LoVo／Adr细胞经PMA作用30min，可以使胞浆中的 PKC．a几乎全部转移到胞膜中，与对照相比PKC－口表达无明显增加； PMA可使胞浆和胞膜中的PKC。表达增强，但无明显转膜迹象；PMA 不能诱导 PKC－r和 PKC－6的表达。LoVo／Adr细胞经PMA作用 24h， 胞浆和胞膜中PKC－口均几乎测不到；PKC＊的含量与PMA作用30min