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第一部分大鼠髓源性树突状细胞的分离培养及其生物学特性的研究目的:探讨大鼠髓源性树突状细胞(bone marrow dendritic cell,BMDC)的体外分离、纯化和扩增的条件。方法:获取大鼠骨髓细胞,以RPMI-1640作为培养基采用分离诱生法进行大鼠树突状细胞的原代培养、纯化及鉴定;用倒置显微镜观察细胞形态,并以台盼蓝拒染法检测细胞的存活率;扫描电镜观察BMDC微观形态;流式细胞仪检测不同时期BMDC表面分子MHCⅡ和CD86的表达水平,采用混合淋巴细胞反应检测不同生长时期BMDC刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。结果:倒置显微镜下可见:前3天大部分细胞呈贴壁生长,体积小,圆形,细胞边界光滑,无树枝样突起,12-14天后则大部分细胞脱壁并已出现典型DC形态,经台盼拒染法测活细胞率高于95%以上。电镜观察细胞表面存在大量褶皱和典型的不规则突起。流式细胞学检测结果显示:培养第6天,大鼠BMDC表面分子低表达,而第14天已经高表达,大鼠BMDC在体外能刺激同种异体T淋巴细胞增殖,并且在培养第14天刺激能力较第6天明显增强(P<0.01)。结论:体外成功地分离及培养了大鼠髓源性树突状细胞。第二部分IDO在树突状细胞的表达及对T淋巴细胞增殖的影响目的:探讨转染细胞毒T细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4 ,CTLA4Ig)基因前后树突状细胞上吲哚胺2,3二氧化酶(indoleamine 2,3 dioxygenase)IDO表达水平及其活性对T淋巴细胞增殖的影响。方法:采用脂质体转染的方法将质粒PGCTLA4Ig和PEGFP转入F344大鼠(供体)髓源性树突状细胞中,用荧光显微镜观察目的基因的表达,以RT-PCR和Western Blot分别检测转染前后BMDC中IDOmRNA和IDO蛋白的表达,以反相高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)检测IDO活性。以Lewis大鼠T淋巴细胞为反应细胞,丝裂霉素C灭活的转染前后不同时间F344大鼠BMDC为刺激细胞建立混合淋巴细胞培养体系(mixed lymphocyte response, MLR)。有或无L-色氨酸存在下,以CCK8检测T淋巴细胞增殖率,用AnnexinV / PI双染色流式细胞术检测T淋巴细胞凋亡;HPLC法检测各MLR体系上清中IDO活性。结果:转染CTLA4Ig后促进树突状细胞中IDO的表达(P<0.01),并且转染后48h DC的IDO活性最高(P<0.01),高表达IDO的树突状细胞在体外能诱导同种异体T细胞凋亡,抑制T细胞增殖,MLR体系中加入L-色氨酸后T淋巴细胞的凋亡率明显下降(P<0.01)。结论:树突状细胞上的IDO表达水平与T淋巴细胞的增殖密切相关,树突状细胞在体外可能通过IDO活性发挥免疫抑制作用。第三部分大鼠同种异体角膜移植模型的建立目的:建立大鼠同种异体角膜移植模型,为下一步排斥反应的研究提供理想的模型方法:以近交系雌性F344大鼠为供体,雌性Lewis大鼠为受体,参照Williams和Coster的方法行偏中心穿透性角膜移植术,受体均选择右眼手术,同时设立对照组(自体原位角膜移植和正常大鼠角膜)。从术后第一日起,受体鼠每日麻醉后在裂隙灯下观察,以混浊、水肿及新生血管三项指标进行评分,判断角膜植片存活时间,术后第5、7、10、14天,取角膜组织行HE染色,进行形态学观察。结果:异体移植组角膜植片全部发生排斥反应,平均存活时间为7.92±1.69天。在自体原位移植组,术后1周前后炎症反应明显,但一周后植片水肿混浊逐渐消退,新生血管通常只到达植片与植床交界处。病理学检查结果显示:发生排斥反应的角膜植片上皮层基本完整,内皮细胞层均不完整甚至大部分缺如,基质纤维增生,结构紊乱,有大量炎性细胞浸润,新生血管随时间推移逐渐增多,自体移植组基质中仅有少量炎症细胞,植片的基质层纤维走行规则,内皮层基本完整。结论:成功建立了大鼠同种异体角膜移植模型第四部分IDO高表达DC对大鼠同种异体角膜移植排斥反应的抑制作用目的:观察高表达IDO的树突状细胞在大鼠同种异体角膜移植中延缓排斥反应发生的体内效果。方法:以雌性F344大鼠为供体,雌性Lewis大鼠为受体,参照Williams和Coster的方法建立大鼠同种异体角膜移植模型。术后将受体大鼠随机分为五组:PBS对照组、CsA治疗组、DC治疗组、诱导DC治疗组和诱导DC+L-色氨酸组。在手术当天和术后第3天分别结膜下注射PBS 50μl、106个F344大鼠BMDC(50μl)、106个转染后48h F344大鼠BMDC(50μl)、106个转染后48h F344大鼠BMDC(50μl,其中L-色氨酸终浓度为250μmol/l),CsA治疗组术后第2天开始用10g/L CsA 50μl滴眼。荧光显微镜观察移植术后BMDC在大鼠体内迁移,TUNEL法检测受体大鼠右侧颌下淋巴结内T淋巴细胞凋亡,单向混合淋巴细胞反应检测治疗后受体鼠的免疫状态,裂隙灯观察各组大鼠角膜植片存活时间。结果:诱导DC治疗组大鼠术后1、4、7天右侧颌下淋巴结内均可见不同数量的表达绿色荧光蛋白的细胞。术后7d在诱导DC治疗组受体鼠的右侧颌下淋巴结内可见明显的凋亡细胞;而其余各组受体鼠的右侧颌下淋巴结内均未见明显凋亡细胞。各组植片存活时间分别为8.19±2.03天、22.36±2.67天、7.05±1.26天、18.33±3.12天9.21±1.85天,诱导DC治疗组和CsA治疗组大鼠植片存活时间明显延长,与其余三组相比有显著性差异(P<0.01),诱导DC治疗组和CsA治疗组大鼠植片存活时间无显著性差异(P>0.05)。诱导DC治疗组和CsA治疗组大鼠脾脏淋巴细胞对供体F344大鼠的单向混合淋巴细胞增殖反应明显降低,与其余三组相比有显著性差异(P<0.01),诱导DC治疗组和CsA治疗组大鼠单向混合淋巴细胞增殖反应无显著性差异(P>0.05)。结论:高表达IDO的树突状细胞能明显延长角膜植片的存活时间,其作用与CsA相当。