禽安卡拉病是由血清型4型禽腺病毒（Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4）引起的一类具有高度传染性的家禽疫病。病鸡死亡迅速,典型的病理变化为心包积液,肝脏肿大、色泽发黄、质地易碎、伴有出血点等。2015年之前该病在我国鲜有发生,但近年来在我国山东、辽宁、吉林、河北等地均有暴发,且死亡率高,给我国家禽养殖业造成巨大的经济损失。目前,国内针对FAdV-4感染的市售疫苗较少,且多为灭活苗和弱毒苗。尽管这两类疫苗能够产生一定的免疫保护效果,但它们仍然存在着保护效果不稳定、毒力返强、继发感染等问题。亚单位疫苗不含有病毒遗传物质核酸,且安全、稳定,是一种理想的候选疫苗。本研究选择FAdV-4衣壳蛋白抗原性较好的多肽片段,设计构建多联融合重组蛋白,制备亚单位疫苗,并评价其免疫保护效力。首先,利用生物信息学工具DNA Star软件和Bepi-Pred 1.0网站对FAdV-4的4种衣壳蛋白Penton、Hexon、Fiber1和Fiber2的氨基酸序列进行抗原性预测,根据预测结果选择抗原性较好的多肽片段,设计并合成四种FAdV-4衣壳蛋白的多抗原表位串联蛋白的编码DNA,分别命名为FAd V4:P、FAd V4:H、FAd V4:F1和FAd V4:F2。然后,利用柔性Linker和限制性内切酶酶切位点的连接方法将这4种多抗原表位串联蛋白的编码DNA连接,获得不同连接顺序的编码多联融合重组蛋白的编码基因,并将它们分别与p ET-28a表达载体连接,获得重组表达质粒并转入E.coli Rosetta（DE3）感受态细胞,成功诱导表达5种多联融合重组蛋白。将纯化后的5种多联融合重组蛋白辅以弗氏佐剂乳化后接种雏鸡,结果表明5种重组蛋白均能刺激机体产生抗体,且抗体维持时间较长,证明构建的多联融合重组蛋白可以用于禽安卡拉病亚单位疫苗候选分子筛选。将构建的5种多联融合重组蛋白,辅以弗氏佐剂制备成5种亚单位疫苗。对SPF鸡进行免疫攻毒实验,通过ELISA和Western blot分析发现各亚单位疫苗组在鸡体内均能产生高水平的特异性抗体;分析死亡率、临床症状、病理剖检等实验结果发现,5种亚单位疫苗免疫保护能力不同,其中FAd V4:F1-P-F2-H疫苗诱导的保护效果最好;荧光定量PCR（q PCR）检测肝组织内病毒载量及HE切片染色结果同样显示FAd V4:F1-P-F2-H疫苗具有良好的免疫保护能力。研究FAdV4:F1-P-F2-H亚单位疫苗最佳免疫剂量及适宜佐剂,结果表明,FAd V4:F1-P-F2-H亚单位疫苗免疫剂量为100μg/只时,免疫保护效果最佳;氢氧化铝溶胶佐剂与弗氏佐剂均能够增强多联融合重组蛋白的免疫原性,发挥同等的免疫保护作用。对血清中细胞因子的表达水平进行检测,结果表明,免疫鸡抗血清中IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-5细胞因子分泌水平明显上调,表明FAd V4:F1-P-F2-H亚单位疫苗诱导机体产生良好的体液和细胞免疫反应。综上所述,本研究以研发禽安卡拉病亚单位疫苗为目标,利用生物信息学工具和网站,根据FAdV-4四种衣壳蛋白Penton、Hexon、Fiber1和Fiber2的较高抗原性肽段,利用限制性内切酶酶切位点连接法成功构建5种多联融合重组蛋白,辅以佐剂免疫雏鸡可诱导机体产生与FAdV-4天然蛋白结合的抗体。通过比较分析制备的5种禽安卡拉病亚单位候选疫苗的免疫保护率、抗体滴度、HE染色组织结构变化和肝组织载毒量,确定多联融合重组蛋白FAd V4:F1-P-F2-H是最佳亚单位疫苗免疫抗原。基于FAd V4:F1-P-F2-H多联融合重组蛋白制备的禽安卡拉病亚单位疫苗,能够有效抵抗FAdV-4感染,可用于FAdV-4导致的禽安卡拉病的预防,为做好禽安卡拉病防控提供一定的技术和产品支撑。