目的:大量流行病学研究发现,桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis,HT)是最常见的器官特异性自身免疫性疾病之一,患者多为女性,目前尚无较好的治疗方法。其发病与多种因素有关,其中免疫损伤被认为是其机制之一,多年来,人们认为免疫系统对正常甲状腺组织成分的自身耐受状态被打破,免疫细胞被甲状腺组织的器官特异性抗原激活、产生自身抗体及相关细胞因子,诱发甲状腺组织中大量淋巴细胞浸润、甲状腺滤泡被破坏,最终导致甲状腺功能低下。什么原因引起机体对甲状腺组织抗原的耐受状态被打破?迄今其机制仍未完全阐明。CD4~+CD25~+调节性T细胞(Regulatory T cells,Tregs)是辅助性T细胞中具有免疫抑制功能的一类重要细胞亚群,能有效调节自身反应性T细胞的功能,对于维持机体免疫自身稳定、预防自身免疫性疾病的发生具有极其重要的作用。人类CD4~+CD25~+Tregs表面组成性表达CD25(IL-2受体α链)分子,特异性表达核叉头/翼状转录因子-3(Forkhead transcription factor protein,Foxp3),并通过分泌抑制性细胞因子如转化生长因子-β1(Transforming growth factor-beta 1,TGF-β1)抑制自身反应性T细胞的功能。多种自身免疫性疾病如类风湿性关节炎、银屑病、系统性红斑狼疮等的发生与CD4~+CD25~+Tregs的数量和/或功能下降有关,为了阐明是否CD4~+CD25~+Tregs的数量和/或功能改变与HT的发生有关,本研究通过流式细胞仪检测HT患者外周血中CD4~+CD25~+Tregs的数量变化;采用磁珠分选技术分离获得CD4~+CD25~+Tregs,通过MTT法检测CD4~+CD25~+Tregs的抑制功能;经实时定量PCR ( Real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测外周血单个核细胞(Peripheril blood mononuclear cell,PBMC)中TGF-β1、Foxp3 mRNA的表达水平,为探寻治疗HT的新思路、新方法提供实验依据。方法:1研究对象收集20例初发HT患者,诊断标准参照《中国甲状腺疾病诊治指南》(中华医学会内分泌学会,2008年)。20例年龄、性别相匹配的健康体检者作为正常对照组。2方法2.1用商用电化学发光试剂盒检测初发HT患者和正常对照组血清中促甲状腺激素(Thyroid stimulating hormone,TSH)、总三碘甲状腺原氨酸(Total triiodothyronine,TT3)、总甲状腺素(Total thyroxine,TT4)、甲状腺球蛋白抗体(Thyroglobulin antibody,Tg-Ab)、甲状腺过氧化物酶抗体(Thyroid peroxidase antibody,TPO-Ab)的水平。2.2采用密度梯度离心法分离新鲜PBMC,流式细胞仪检测初发HT患者和正常对照组PBMC中CD4~+T细胞、CD4~+CD25~+T细胞的数量。2.3采用磁珠分选技术分离初发HT患者和正常对照组CD4~+CD25~+Tregs和CD4~+CD25-T细胞,用MTT法检测CD4~+CD25~+Tregs对自身CD4~+CD25-T细胞接受刺激后增殖的抑制作用。2.4提取初发HT患者和正常对照组PBMC的总mRNA,反转录后,经qRT-PCR检测TGF-β1、Foxp3 mRNA的表达水平,以人GAPDH作为内参照基因。2.5对初发HT患者自身抗体Tg-Ab、TPO-Ab与CD4~+T细胞百分率、CD4~+CD25~+T细胞百分率、TGF-β1及FoxP3 mRNA相对表达量做相关性分析。结果:1血清TSH、TT3、TT4、Tg-Ab、TPO-Ab水平检测初发HT患者与正常对照组比较血清TSH、TT3、TT4水平无统计学差异(P>0.05);初发HT患者血清Tg-Ab、TPO-Ab水平与正常对照组比较明显增高。(Table.1)2外周血CD4~+T细胞和CD4~+CD25~+Tregs的数量比较初发HT组和正常组的CD4~+T细胞数量无统计学差异(P>0.05);初发HT患者PBMC中CD4~+CD25~+Tregs占CD4~+T细胞的比率为(1.55±0.49%),明显低于正常对照组(2.86±1.04%)(P<0.05)。(Table.2)3 CD4~+CD25~+ Tregs对自身CD4~+CD25-T细胞增殖的抑制作用为研究初发HT患者的CD4~+CD25~+ Tregs对自身CD4~+CD25-T细胞的抑制功能,本试验应用磁珠分选技术分选了5例初发HT患者和5例正常人的CD4~+CD25~+Tregs和CD4~+CD25-T细胞,检测两组的CD4~+CD25~+Tregs对自身CD4~+CD25-T细胞(按1:1比例)增殖的抑制作用。结果发现,两组CD4~+CD25-T细胞经抗CD3抗体和灭活的自身抗原提成细胞(Antigen present cell,APC)刺激后活化增殖均非常明显,但两组间无统计学差异(P>0.05);两组CD4~+CD25~+Tregs经抗CD3抗体和灭活的自身APC刺激后活化增殖均不明显;初发HT患者外周血中CD4~+CD25~+Tregs对自身CD4~+CD25-T细胞增殖的抑制百分率为(15.7±5.36%)明显低于正常组(41.7±9.87%)(P<0.05)。(Fig.7)4 PBMC中TGF-β1、Foxp3 mRNA表达水平qRT-PCR结果显示:初发HT组PBMC中TGF-β1 mRNA(0.43±0.10)和Foxp3 mRNA(0.42±0.29)与正常对照组(1.02±0.04)和(0.99±0.17)比较均明显降低(P<0.05)。(Fig. 12)5初发HT患者自身抗体Tg-Ab、TPO-Ab与CD4~+T细胞百分率、CD4~+CD25~+T细胞百分率、TGF-β1及Foxp3 mRNA表达量相关性分析初发HT患者Tg-Ab、TPO-Ab水平与CD4~+T细胞百分率之间无相关关系(P>0.05);(Fig. 13A,Fig. 13B)Tg-Ab水平与CD4~+CD25~+T细胞百分率之间呈负相关(r=-0.548,P<0.05);(Fig. 14A)TPO-Ab水平与CD4~+CD25~+T细胞百分率之间呈负相关(r=-0.585,P<0.05);(Fig. 14B)TPO-Ab水平与TGF-β1 mRNA表达量之间呈负相关(r=-0.695,P<0.05);(Fig. 15A)TPO-Ab水平与Foxp3 mRNA表达量之间呈负相关(r=-0.629,P<0.05);(Fig. 15B)Tg-Ab水平与TGF-β1、Foxp3 mRNA表达量之间均无相关关系(P>0.05);(Fig. 16A,Fig. 16B)CD4~+CD25~+T细胞百分率与TGF-β1 mRNA表达量呈正相关( r=0.709 , P<0.05 );( Fig. 17A )CD4~+CD25~+T细胞百分率与Foxp3 mRNA表达量亦呈正相关(r=0.591,P<0.05)。(Fig. 17B)结论:1初发HT患者外周血中CD4~+CD25~+Tregs的数量明显降低。2初发HT患者CD4~+CD25~+Tregs的抑制功能明显降低。3初发HT患者PBMC中TGF-β1、Foxp3 mRNA表达量明显降低。4初发HT患者Tg-Ab、TPO-Ab水平与CD4~+CD25~+T细胞百分率呈负相关;TPO-Ab水平与TGF-β1、Foxp3 mRNA表达量呈负相关;CD4~+CD25~+T细胞百分率与TGF-β1及Foxp3 mRNA表达量呈正相关。5外周血中CD4~+CD25~+Tregs的数量减少和功能降低使TPO-Ab产生增加参与了HT的发生。第二部分Th17细胞与桥本甲状腺炎相关研究目的:Th17细胞是新近发现的新型CD4~+T细胞亚群,其与Th1、Th2细胞不同,具有独立的细胞分化、发育和生物学功能。Th17细胞特异性表达核转录因子视黄酸受体相关孤独受体γ(tRetinoic acid receptor-related orphan receptorγt,RORγt)并主要分泌细胞因子IL-17(即IL-17A)。IL-17是促炎症因子,可招募和活化中性粒细胞,提高T细胞免疫反应和促进炎症介质的释放,对于宿主清除病原体和发生自身免疫性疾病以及诱导组织炎症均具有重要作用。已有研究发现,在人类许多自身免疫性疾病(如克隆病、银屑病和特应性皮炎等)患者的血浆或组织中有IL-17A的出现,最新研究证实了Th17细胞作为新的CD4~+T细胞亚群确实对于这些疾病的发生具有重要作用。但有关Th17细胞与人类桥本甲状腺炎的研究还很少。本研究通过ELISA检测血浆中IL-17水平;采用qRT- PCR检测PBMC中RORγt、IFN-γ、IL-4 mRNA的表达量;通过免疫组织化学染色方法检测甲状腺组织中IL-17~+细胞的分布及数量变化,探讨Th17细胞在HT发生中的作用。方法:1研究对象及材料初发HT患者和正常组各20例同第一部分。免疫组化标本来自12例HT患者手术切除的甲状腺组织和4例创伤死亡的正常甲状腺组织。2方法2.1用人IL-17 ELISA试剂盒检测初发HT患者和正常对照组血浆中IL-17的水平。2.2提取初发HT患者和正常对照组PBMC的总mRNA,经qRT-PCR检测RORγt、IFN-γ、IL-4 mRNA的表达量,以人GAPDH作为内参照基因。2.3应用免疫组织化学染色方法观察甲状腺组织中IL-17~+细胞的分布和数量。结果:1血浆中IL-17的水平因两组血浆中IL-17水平均很低,用试剂盒均未检出。2 PBMC中RORγt、IFN-γ、IL-4m RNA的表达初发HT组PBMC中RORγt表达水平(1.95±0.65)与正常对照组(1.3±0.71)比较明显增高(P<0.05);而IFN-γ、IL-4 mRNA的表达水平与正常对照组比较无显著性差异(P>0.05)。(Fig. 1)3甲状腺组织中IL-17~+细胞的分布和数量免疫组化结果显示:HT组和正常对照组的甲状腺组织中均有IL-17~+细胞的出现,IL-17~+细胞主要为淋巴细胞,HT组IL-17~+细胞数较正常对照组明显增多。(Fig. 2,Fig. 3,Fig. 4)结论:1初发HT患者血浆中IL-17水平未检出。2初发HT患者PBMC中RORγt表达水平明显增高,甲状腺组织中有大量IL-17~+淋巴细胞浸润。提示Th17细胞可能在HT发生中发挥作用。