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目的三邻甲苯磷酸酯(Tri-ortho-cresyl phosphate,TOCP)是工业生产中广泛使用的有机磷化合物。人类暴露TOCP可导致一种迟发性神经病(organophosphate-induced delayed neuropathy,OPIDN)的发生,到目前为止其确切发生机制尚不清楚。以前的研究显示OPIDN中神经轴突的病理变化与物理截断引起的轴突wallerian变性相似,即神经轴突自末端向胞体进行性地变性、解体。自噬是真核细胞中负责蛋白质和细胞器清除的主要机制,对于神经元维持自身稳态具有重要作用。众多研究证明神经元自噬异常和轴突变性有关。在本研究中,我们利用自噬相关基因Atg7敲除的自噬缺陷N2a细胞建立中毒模型,研究自噬在TOCP诱导的Neuro-2a(N2a)轴突损伤中的作用,探索TOCP诱导迟发性神经病的发生机制。方法1.细胞毒性实验:CCK8方法测试不同浓度TOCP对N2a细胞增殖的影响,确定OPIDN细胞模型中TOCP染毒剂量。2.细胞分化实验:培养野生型和Atg7基因敲除的自噬缺陷型N2a细胞,分别使用低血清和视黄酸(Retinoic acid,RA)两种方法诱导野生型N2a细胞(Atg7+/+N2a)和自噬缺陷N2a细胞(Atg7-/-N2a),分化24h、48h,直至呈现典型的神经元形态。3.细胞分化能力和轴突损伤情况检测实验:利用0、1.25、2.5、5、10、20μM TOCP处理Atg7+/++N2a细胞,观察毒物对细胞分化能力的影响。在此基础上,以0、5、10μM浓度的TOCP染毒低血清和视黄酸两种方法诱导分化的Atg7+/+N2a细胞和Atg7-/-N2a细胞,观察比较两种N2a细胞轴突变化情况。4.细胞免疫荧光实验:使用免疫荧光法检测0、5、10μM TOCP处理后的Atg7+/+N2a细胞和Atg7-/-N2a细胞中轴突转运蛋白dynaction和自噬标志蛋白LC3B的变化水平。5.蛋白免疫印迹实验:Western blotting检测Atg7+/+N2a细胞和Atg7-/-N2a细胞中 LC3、p62、p-p62、beclin-1、Ub、k48-Ub、k63-Ub 等自噬相关蛋白,kinesin、dynactin等轴浆运输马达蛋白,以及促进轴突损伤相关蛋白SARM1的表达和MAPK信号通路关键分子的磷酸化水平的变化。6.实时荧光 PCR(Quantitative Real-time PCR,Q-PCR)实验：使用 Q-PCR 检测细胞自噬相关基因LC3B、beclin1和转录因子EB的mRNA表达情况,以及轴突变性相关的关键分子 calpain-1、calpain-2、nmnat-2、sarm1、DLK 和 scg10 等基因的mRNA表达水平。结果1.CCK8法检测结果显示,TOCP染毒剂量超过20μM后,随着剂量的增加,对细胞增殖抑制作用越来越明显,直至超过1OO0μM后细胞活性为零。2.低血清和RA两种方法诱导48h之后均可使两种N2a细胞分化成功,即突起长度超过胞体两倍。其中,RA诱导分化的细胞轴突分化长度更明显。3.①Atg7+/+N2a细胞染毒TOCP之后,明显影响了其分化能力,且随着剂量的增加,抑制分化能力越明显。②使用TOCP染毒后,两种细胞轴突长度明显缩短,且随着TOCP染毒剂量增加,轴突损伤逐渐加重。同一剂量下,Atg7-/-N2a细胞轴突缩短程度相较于野生型的小。4.免疫荧光结果显示,随着TOCP染毒剂量的增加,两种细胞中轴突微管马达蛋白Dynactin表达下降,标记自噬泡绿色荧光亮点增多。两种细胞间无显著性差异。5.Western blotting 实验结果显示:Atg7+/+N2a 细胞中 beclin-1 含量减少,LC3-Ⅱ含量明显增加,Atg7-/-N2a细胞中beclin-1同样呈现下降趋势,LC3-Ⅱ不表达。两种细胞中p-p62水平上调,Atg7-/-N2a细胞中p-p62表达量更高。高剂量组两种细胞中轴突运输马达蛋白dynactin和kinesin表达均减少。两种细胞中K48-位点泛素蛋白水平增加,Atg7-/-N2a细胞表达量更高。Atg7+/+N2a细胞中对轴突损伤具有促进性作用的激酶p-p38、p-p42/p44磷酸化水平上升,p-jnk表达下调,蛋白SARM1表达增加,而Atg7-/-N2a细胞中除激酶p-p38呈现上升趋势外,其余均无显著性差异,p-p42/p44在两种细胞间变化具有统计学差异,Atg7+/+N2a细胞磷酸化水平更高。6.荧光定量PCR检测发现:自噬相关基因LC3B、beclin1、转录因子EB的mRNA水平在两种细胞中随着药物剂量的增加而逐步上升。calpain-1在高剂量染毒的Atg7+/+N2a细胞中激活,而在Atg7-/-N2a细胞中calpain-1、calpain-2均被激活。对轴突损伤起保护作用nmnat2基因表达情况是:Atg7+/+N2a细胞逐步上升,而Atg7-/-N2a细胞呈下降趋势,0、5μMTOCP处理组中Atg7-/-N2a细胞表达量更高。同轴突损伤相关的sarm1在高剂量染毒的两种细胞中显著性增加。高剂量组Atg7+/+N2a细胞中DLK含量上升,而Atg7-/-N2a细胞却呈现相反趋势。结论1.TOCP染毒影响了 Atg7+/+N2a和Atg7-/-N2a细胞的分化能力,并能引起已分化的N2a细胞的轴突损伤,其中Atg7+/+N2a细胞的损伤程度比Atg7-/-N2a细胞更加严重。2.TOCP染毒引起N2a细胞自噬激活,而Atg7-/-N2a基因敲除导致细胞自噬活性丧失,同时影响了细胞中促轴突存活和促细胞死亡信号关键因子NMNAT2、Sarm1、DLK 和 MAPK 激酶等。3.自噬基因Atg7敲除能减轻三邻甲苯磷酸酯对Neuro-2a细胞轴突的损伤。