论文部分内容阅读
目的:本研究通过siRNA干扰技术沉默PC4基因,探索PC4基因对宫颈腺癌Hela细胞放射敏感性的影响及其可能的机制,为宫颈癌的放疗增敏寻找新的方向. 方法:(1)免疫组织化学实验检测PC4蛋白在正常宫颈上皮、宫颈腺癌、宫颈鳞状细胞癌组织中的表达情况.(2)蛋白质印迹法检测人宫颈腺癌Hela细胞及鳞状细胞癌Siha细胞中PC4蛋白的表达差异.(3)克隆形成实验检测人宫颈腺癌Hela细胞及鳞癌Siha细胞的放射敏感性差异.(4)构建沉默PC4基因的siRNA和阴性对照siRNA,转染人宫颈腺癌细胞系Hela细胞,实验设立PC4基因沉默组(siRNA PC4)、空白对照组(control)和阴性对照组(siRNA NC).(5)应用Western blot实验检测PC4基因在蛋白水平上表达的变化,从而鉴定siRNA的有效性.(6)MTT法检测转染前后细胞的增殖情况.(7)克隆形成实验分析沉默PC4基因对Hela细胞放射敏感性的影响.(8)流式细胞术检测放疗前后细胞的周期分布和凋亡率.(9)免疫荧光实验检测细胞经照射后DNA双链断裂修复情况.(10)蛋白质印迹方法检测经放射治疗后,细胞调亡及DNA损伤修复蛋白的表达情况. 结果:(1)免疫组织化学实验显示PC4蛋白在宫颈腺癌组织中的表达显著高于鳞状细胞癌和正常宫颈上皮组织.(2)Western blot结果显示人宫颈腺癌Hela细胞中PC4蛋白表达明显高于鳞癌Siha细胞.(3)克隆形成实验提示人宫颈腺癌Hela细胞较鳞癌Siha细胞放射抵抗强.(4)Western blot结果显示PC4siRNA转染Hela细胞后,PC4蛋白表达明显降低,成功构建沉默PC4基因的hela细胞株.(5)MTT实验显示靶向沉默PC4表达对Hela细胞的增殖无明显影响(P>0.05).(6)克隆形成实验显示沉默PC4基因增加Hela细胞的放射敏感性.(7)流式细胞术检测结果显示,与阴性对照组相比,沉默PC4基因组细胞(si RNA PC4)照射后凋亡水平明显增高;细胞S期百分比降低,G2/M期百分比增高(P<0.05).(8)免疫荧光实验提示沉默PC4基因,照射后细胞核内的γ-H2AX焦点数明显增加(P<0.05),尤其在放疗后0.5h和6h.(9)Western blot结果提示相对于阴性对照组,沉默PC4基因组细胞经照射后,cleaved PARP和γ-H2AX蛋白的表达增高,DNA ligase IV、XRCC4和XLF蛋白的表达降低. 结论:(1)PC4蛋白在宫颈腺癌组织中的表达高于鳞状细胞癌;(2)沉默PC4基因照射后hela细胞周期阻滞于G2/M期、细胞凋亡增加;(3)沉默PC4能减少照射后hela细胞DNA双链断裂的有效修复;(4)沉默PC4表达可能通过抑制DNA ligaseⅣ/XRCC4/XLF复合物的形成,减弱照射后细胞DNA双链断裂的修复,从而增加细胞的放射敏感性.(5)PC4基因的过表达可能与宫颈腺癌放射抵抗相关.