嗜神经病毒是一类对神经系统高度敏感的病毒,多种嗜神经病毒具有严格的神经嗜性,并且在感染后能够沿特定方向跨突触传播。随着基因工程和反向遗传学技术的迅速发展,嗜神经病毒被改造为多种形式的环路标记工具,用以解析中枢神经系统的神经环路连接网络。而且可结合钙离子指示蛋白、光遗传和化学遗传工具特异性地监测和操纵神经环路的活性,对神经环路的功能进行研究。嗜神经病毒在神经元内的转运方向具有一定的偏好性。单纯疱疹病毒(HSV)的HSV129毒株和水泡性口炎病毒(VSV)主要以顺行方向转运,被作为神经环路顺向标记工具。狂犬病毒(RABV),犬腺病毒2型(CAV),伪狂犬病毒(PRV)的bartha株和逆行标记的腺相关病毒rAAV2-retro沿轴突逆行转运,被改造用于神经环路的逆向标记。根据病毒的复制能力分为不跨突触的标记病毒和跨多级突触的标记病毒。不跨突触的标记病毒为复制缺陷型病毒,如G蛋白缺失的狂犬病毒(RABV-SAD-?G),E1蛋白缺失的犬腺病毒(CAV2)和rAAV2-retro,用以标记注射位点的一级环路连接。跨多级突触的标记病毒为复制完整型病毒,包括PRV的bartha株、RABV的固定毒株、HSV的H129毒株,随着病毒的复制,可跨突触标记核团的多级环路。如此繁多的病毒标记工具,使科研工作者能够更全面的解析大脑的神经连接以及信号传递模式。在不同的研究中该如何准确的选择有效的病毒工具,依赖于我们对不同病毒特性的了解。不同来源的标记病毒具有不同特性,包括病毒结构、基因组、受体蛋白、复制包装等过程,病毒只能够入侵表达对应受体蛋白的神经元,进入神经元后通过与宿主蛋白的相互作用,完成病毒的复制、包装等过程。神经网络由种类繁多的神经元构成,不同类型的神经元的基因表达各不相同。以上病毒与宿主之间的差异可能会导致嗜神经病毒对不同类群的神经元具有不同的神经嗜性,造成神经环路标记的不一致。然而,目前对不同示踪病毒的神经嗜性比较,及其在环路标记的影响并没有系统的研究报道。本课题对目前常用的跨多级示踪病毒和不跨突触的示踪的病毒的神经嗜性和毒性进行系统的分析比较,为神经环路标记工具的合理应用提供参考。1.多级逆行示踪病毒神经嗜性比较将表达绿色荧光蛋白的RABV的固定毒来源的CVS-B2c-EGFP和PRV Bartha株来源的PRV-152(EGFP)分别注射在小鼠的腘淋巴结。病毒粒子被支配淋巴结的神经末吸收后沿神经纤维逆行标记支配淋巴结的神经元,随着病毒的复制和跨突触感染,大脑内的高级神经连接网络被标记。通过全脑切片成像,对两种病毒标记的神经元的核团位置和数量进行分析比较,结果显示通过以上两种逆向标记病毒绘制的神经环路存在差异。2.单级逆行示踪病毒神经嗜性比较将几种常用的复制缺陷型病毒SAD-?G、rAAV2-retro、CAV2-Cre以及一种化学示踪剂green retrobeads分别注射在鼠脑的相同核团,标记注射位点的一级输入环路。通过全脑切片、成像,对不同病毒标记的神经元的核团和数量进行统计分析。结果发现不同病毒标记的神经环路并不完全一致。进一步通过Cre/Lox重组酶系统放大荧光蛋白信号排除不同病毒荧光蛋白表达差异;通过混合注射,排除注射误差后,依然能够观察到标记差异。这说明不同的标记病毒对大脑内的神经元类群存在嗜性偏好。在对下丘脑的环路进行标记时,rAAV2-retro更倾向于标记皮层,而SAD-?G倾向于标记下丘脑和基底神经节。3.病毒神经嗜性差异机制的初步探索病毒利用细胞膜上的受体感染进入神经元,不同类型的病毒只识别并结合其对应的特异受体蛋白。而且大脑内的神经元种类繁多、功能各异,基因表达必定存在差异。因此,我们推测病毒具有神经嗜性差异的重要因素是神经元轴突末梢的病毒受体表达不均一,从而造成病毒对不同类群的神经元具有选择性。我们在RABV不敏感的神经元过表达禽白血病病毒受体(TVA)后,能够明显提高对应配体EnvA(禽白血病病毒囊膜蛋白)假包装的狂犬病毒的感染性。这说明神经元表达对应病毒受体后,能够提高该病毒的神经嗜性。为了进一步探索决定神经嗜性的分子机制,我们建立了鼠脑神经元的单细胞分离方法,分离SAD-?G和rAAV2-retro标记的神经元,并进行单细胞测序。对22群SAD-?G标记的神经元和21群rAAV2-retro标记的神经元的转录组进行分析,推测造成两种病毒神经嗜性差异的分子机制。4.示踪病毒的毒性比较示踪病毒注射后由于病毒的感染和基因的表达势必会对脑组织产生一定的毒性。我们首先通过组织RNA-seq对注射位点和逆标记位点组织的转录组进行测序,分析病毒标记对脑组织基因表达的影响。结果显示病毒标记诱导大量免疫相关基因的表达,SAD-?G对注射位点和逆标记位点的基因表达的改变比rAAV2-retro更显著。进而通过免疫组织化学染色观察到SAD-?G标记后在注射位点和逆标记位点出现小胶质细胞的大量激活,rAAV2-retro仅在注射位点引起小胶质细胞的激活,而在逆标记位点并未出现明显的激活现象。同时我们还发现SAD-?G逆标记会引起催产素基因的高表达。5.多种示踪病毒联合应用标记高级神经环路通过以上研究我们发现,不同来源的示踪病毒的神经嗜性存在差异。我们利用病毒的神经嗜性差异,对多种单级示踪病毒联合应用,提出解析特定核团的二级输入环路策略。本研究通过比较不同嗜神经病毒对大脑内神经元的感染特性,确定嗜神经病毒对大脑内的神经元存在嗜性差异,并且通过单细胞测序分析造成病毒神经嗜性差异的分子机制。同时比较了不同嗜神经病毒改造的神经环路标记工具在脑组织内产生的毒性反应。以上研究为嗜神经病毒感染机制研究提供新的思路,同时也为嗜神经病毒在神经环路中的正确应用提供参考。