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【研究背景与研究目的】肝纤维化的病理生理发展过程与肝脏微环境中的多种炎性介质和细胞因子密切相关，其中最主要的就是各种促进纤维化发生发展的生长因子，这些生长因子主要包括TGF-β1、PDGF、CTGF、FGF、VEGF等等，这些生长因子发挥作用都需要和细胞表面的生长因子受体结合，进而激活与受体耦合的细胞内信号通路。这些生长因子和细胞表面的生长因子受体结合时，大多还需要存在于细胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）分子中的硫酸乙酰肝素（HS）作为共同配体或提供空间构象。而大量研究表明，Sulf-1基因编码的硫酸酯酶恰好可以使硫酸乙酰肝素蛋白聚糖分子中的硫酸乙酰肝素发生去硫酸化，进而使硫酸乙酰肝素蛋白聚糖分子失去为生长因子受体提供共同配体和提供空间构象的能力，从而阻断生长因子信号的传递。我们猜测，Sulf-1基因同样能阻断与促进肝纤维化发生发展有关的生长因子的信号传递，从而达到阻断肝纤维化进程的目的。目前对肝纤维化的研究结果显示，在肝纤维化进程中起关键作用的就是肝星状细胞。于是，我们首先分离并检测了大鼠原代肝星状细胞中大鼠Sulf-1基因的表达水平随原代肝星状细胞激活状态的变化，构建了人Sulf-1基因的腺病毒载体Ad5-hSulf1，人Sulf-1基因的沉默载体hSulf1-shRNA，检测了在腺病毒和shRNA介导下肝星状细胞系LX-2和HSC-T6中Sulf-1基因高表达和沉默时肝纤维化指标的变化，证明了Sulf-1基因能有效抑制肝星状细胞的激活和胶原蛋白的分泌。同时，我们进一步构建了人Sulf-1基因的N端活性片段的质粒载体pDC315-NSulf1，验证了NSulf-1与hSulf-1全长基因有类似的抗纤维化作用，为探索理想的抗纤维化基因治疗手段打下基础。【研究方法】1、分离培养并且鉴定原代肝星状细胞，检测原代肝星状细胞激活过程中Sulf-1基因表达水平的变化。(1)采用肝脏原位灌注和密度梯度离心法分离Wistar大鼠肝脏的原代肝星状细胞。计数每只大鼠分离的细胞产量，台盼蓝检测分离的原代肝星状细胞的活力。(2) Western Blot检测原代肝星状细胞中α-SMA、Desmin、GFAP、F4/80的表达，达到鉴定原代肝星状细胞的目的。(3)在原代肝星状细胞培养的0、3、5、7天，PCR检测原代肝星状细胞中Sulf-1基因的表达水平。2、 MTT法检测重组TGF-β1因子对肝星状细胞系LX-2和HSC-T6增殖能力的影响，检测重组TGF-β1因子刺激肝星状细胞系LX-2增殖的最适刺激浓度和刺激时间。(1)检测不同时间跨度的重组TGF-β1因子对肝星状细胞系LX-2和HSC-T6增殖能力的影响。(2)检测不同浓度梯度的重组TGF-β1因子对肝星状细胞系LX-2和HSC-T6增殖能力的影响。3、构建hSulf-1基因的腺病毒载体Ad5-hSulf1及其N端活性片段腺质粒载体pDC315-NSulf1，构建沉默hSulf-1基因的shRNA载体hSulf1-shRNA，分别采用感染和转染的方法在肝星状细胞系LX-2中建立hSulf-1基因高表达和低表达的细胞系。(1)不同病毒滴度的hSulf-1基因的腺病毒载体Ad5-hSulf1感染肝星状细胞系LX-2，RT-PCR检测不同病毒感染滴度下hSulf-1基因的表达，确定使hSulf-1基因高表达的最佳病毒感染滴度。(2) hSulf1-shRNA转染肝星状细胞系LX-2，RT-PCR检测hSulf-1基因的沉默效果。4、检测在重组TGF-β1因子刺激下的肝星状细胞系LX-2和HSC-T6中hSulf-1基因高表达及低表达时肝纤维化相关的效应指标的变化，验证NSulf-1基因对TGF-β1因子刺激下肝星状细胞系LX-2中肝纤维化相关的效应指标的变化的影响。(1)重组TGF-β1因子刺激条件下，Ad5-Sulf1和hSulf1-shRNA干预肝星状细胞系LX-2和HSC-T6，PCR检测肝纤维化相关的效应指标α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ、TIMP-1的变化。(2)重组TGF-β1因子刺激条件下，Ad5-Sulf1和pDC315-NSulf1干预肝星状细胞系LX-2和HSC-T6，PCR检测肝纤维化相关的效应指标α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ、TIMP-1的变化，Western-blot检测PCR检测肝纤维化相关的效应指标α-SMA、TGF-β1、CollagenⅠ、CollagenⅢ的变化，检测信号通路分子p-ERK、p-AKT、p-Smad2的变化。【实验结果】1、 Western blot鉴定指标显示，正确分离出原代肝星状细胞。平均每只大鼠的原代肝星状细胞的产量为(3.008±0.3)×107个/只，细胞活力的平均值为(95.80±1.9)%。PCR结果显示，原代肝星状细胞在培养自发激活的过程中Sulf-1基因的表达水平逐渐下降。2、刺激肝星状细胞系LX-2增殖的最佳重组TGF-β1因子干预条件为：5ng/ml，24h；刺激肝星状细胞系HSC-T6增殖的最佳重组TGF-β1因子干预条件为：7.5ng/ml，24h。3、 Ad5-hSulf1感染肝星状细胞系LX-2的最佳病毒滴度为MOI=50，hSulf1-shRNA可以使肝星状细胞系LX-2中的Sulf1基因沉默，最佳转染条件为hSulf1-shRNA为2.5ug，Lipo2000Agent为7.5ul。4、 Ad5-Sulf1能减弱重组TGF-β1因子刺激条件下，肝星状细胞系LX-2和HSC-T6中检测肝纤维化相关的效应指标α-SMA、TGF-β1、CollagenⅠ、CollagenⅢ、TIMP-1的的表达，能减弱信号通路分子p-ERK、p-AKT、p-Smad2的表达。沉默hSulf-1基因对肝星状细胞系中肝纤维化相关的效应指标的作用不明显。pDC315-NSulf1具有与Ad5-hSulf1类似的抗纤维化作用。【实验结论】本实验分离鉴定了大鼠原代肝星状细胞，证明了Sulf-1基因的表达水平在原代肝星状细胞自发激活的过程中逐渐下降。构建了hSulf-1基因的腺病毒载体Ad5-hSulf1及其N端活性片段质粒载体pDC315-NSulf1，构建沉默hSulf-1基因的shRNA载体hSulf1-shRNA。检测了在重组TGF-β1因子刺激条件下，肝星状细胞系LX-2和HSC-T6中hSulf-1基因高表达及低表达时肝纤维化相关的效应指标的变化，证明hSulf-1基因在肝星状细胞系LX-2和HSC-T6中高表达时，能有效减弱肝纤维化相关的效应指标α-SMA、TGF-β1、CollagenⅠ、CollagenⅢ、TIMP-1的的表达，能减弱信号通路分子p-ERK、p-AKT、p-Smad2的表达。证明了pDC315-NSulf1具有与Ad5-hSulf1类似的抗纤维化作用，为探索理想的抗纤维化基因治疗手段打下了基础。