黄瓜(Cucumis sativus L.)在世界上分布很普遍,是食用非常多的蔬菜之一,在我国蔬菜种植中所占比例在20%左右,在黄瓜主产区越冬蔬菜种植中比例高达50%。但是随着农业的产业化、集约化发展,长期连作导致黄瓜的品质下降、产量降低和严重的土传病害等一系列问题。黄瓜连作土传枯萎病由尖孢镰刀菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum, FOC)引起,一般导致 10-30%的黄瓜植株发病,严重时候高达70%,甚至绝收。黄瓜连作土传枯萎病已成为黄瓜生产上的主要限制因子。本研究针对黄瓜连作土传枯萎病的发生机理,运用生物防治和生物修复的手段缓解黄瓜土传枯萎病的危害,研究了(1)黄瓜连作土壤尖孢镰刀菌的数量、致病性尖抱镰刀菌的比例,环境因子及其交互作用对黄瓜连作土壤尖抱镰刀菌生长的影响;(2 )黄瓜在连作土壤中分泌的主要化感物质的分离、鉴定;具有生防黄瓜专化型尖孢镰刀菌功能和降解化感物质功能的微生物菌株筛选、鉴定;(3 )功能菌株拮抗病原菌的代谢物质的分离、鉴定及其对连作土壤黄瓜枯萎病的防治效果和土壤尖孢镰刀菌的抑制效果;(4)功能菌对连作土壤中化感物质的降解以及对土壤微生物区系的修复;(5)功能菌生防黄瓜土传枯萎病最佳模式的筛选;采用固体有机废弃物作为基质结合统计学方法优化固体发酵过程生产功能菌及其代谢拮抗物质,功能菌固体发酵产品(微生物有机肥,BIO)施用在营养钵育苗和大钵移栽土壤(模拟田间)上的生防效果、土壤微生物区系的修复效果,以及BIO对黄瓜连作大田枯萎病的生防效果等方面,得到如下结果:浙江省金华市黄瓜塑料大棚连作土壤中F.oxyspor. 的培养分析显示,该连作土壤F.oxyspor. 的数量为2.02 × 103 CFU g-1干土,对黄瓜具有致病力的菌株占95.8%,其中能够侵染较抗病品种“津春4号”的强致病力菌株占74.6%。通过形态学、分子生物学和寄主专化型鉴定得知强致病力菌株为F. oxysorf. sp. cucumerinum。三因子响应曲面(Response Surface Methodology)法测定表明,温度、pH和水势都对土壤F.oxysporum数量有显著的影响(p<0.05),该模型 预测的结果显示土壤水势为-8.1kPa,温度为27.4℃, pH为5.4的时候,土壤的FOC数量达到最大值。这个条件与实际田间黄瓜的枯萎病大规模发生时候的土壤条件是一致的。经形态学和系统发育分析手段鉴定了筛选到的兼具生防FOC和降解利用黄瓜分泌的化感物质功能的微生物菌株,该菌株为哈兹木霉(Trichoderma harzianum),编号SQR-T037。该菌株能够在单一的化感物质作为唯一碳源的培养基、混合化感物质作为碳源的培养基和营养充足但是添加混合化感物质的培养基中快速地利用化感物质进行生长和繁殖,且无新的酚酸类化感物质生成。根盒实验结果显示该菌株可以原位降解黄瓜分泌的化感物质,减少化感物质在土壤中的累积。平皿对峙实验表明,相对于对照FOC (不受SQR-T037生物防治影响的FOC菌株),SQR-T037对FOC抑制率为91.4%。该菌株不具有生物毒性,能够控制连作土壤上黄瓜枯萎病的发生,增加黄瓜苗干重,能够分泌活性很强的几丁质酶、β-l,3-葡聚糖酶、纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、果胶酶和蛋白酶。该菌株生长最佳的培养基为PDA培养基,最佳pH值是6.5,最佳生长温度为24℃;产生拮抗FOC菌株的物质最佳培养基为PDA培养基何玉米粉蔗糖培养基,在PDA培养基上培养产生拮抗物质最佳pH值为6.0,最佳温度为25C。该菌株能够耐受较高浓度的杀菌剂、杀虫剂、除草剂以及化学肥料。通过HPLC (High Performance Liquid Chromatography)分离、标准品比对和质谱分析检测了黄瓜根盒培养方式下收集到的黄瓜根系分泌物,其结果显示黄瓜在连作土壤中分泌的化感物质主要为对羟基苯甲酸、香草酸、阿魏酸、苯甲酸、苯丙酸和肉桂酸等酚酸。黄瓜连作大田的土壤中,能够检测到对羟基苯甲酸、肉桂酸和苯甲酸,其浓度分别为1.6、6.6和2.4μg kg-1干土壤,该三种酚酸浓度很快降低,黄瓜收获后第10天,分别降低到原来浓度的38.9%、35.3%和53.0%,第30天的时候土壤检测不到酚酸类物质。SQR-T037对黄瓜根系分泌物和黄瓜收获之后根系腐解物中的化感物质降解效果显示,SQR-T037显著降低根系分泌的、释放到土壤中的化感物质的量,其对对羟基苯甲酸、香草酸、阿魏酸、苯甲酸、苯丙酸和肉桂酸的降解能力分别为88.8%、90.0%、100%、94.9%、100%和100%。SQR-T037能够降解黄瓜收获之后根系腐解物中的化感物质,只有在黄瓜收获后第40天,SQR-T037处理能够检测到少量对羟基苯甲酸、肉桂酸和苯甲酸,其浓度分别为对照处理的15.9%、2.9%和33.5%,其他时间SQR-T037处理检测不到化感物质。黄瓜连作土壤中尖孢镰刀菌数量随着根系的腐解而不断增加,接种SQR-T037能够抑制尖孢镰刀菌的增殖,使其维持在较低的水平。SQR-T037发酵代谢物通过馏分收集和HPLC纯化分离出一种具有抑制FOC的活性物质,通过质谱(MS)和核磁共振(NMR)分析鉴定为6-戊基-α-吡喃酮(6-pentyl-α-pyrone, 6PAP) 。 系列浓.度的 6PAP(50、150、250、350 和 450mgL-1)对FOC的抑制效果显示,随着6PAP浓度的增加,抑菌效果逐渐增强。相较于对照,6PAP在350 mg L-1的时候,对菌丝生长和孢子萌发的抑制率分别为73.7%和79.6%;6PAP浓度为150 mg L-1的时候,对FOC产孢和单位菌丝的镰刀菌酸产量的抑制效果分别为88.0%和52.7%。黄瓜连作土壤6PAP施用量为350和450 mg kg-1 土壤的时候,土壤中F.oxysporum 数量分别降低了 41.2%和83.2%; 6PAP施用量为350 mg kg-1 土壤的时候,枯萎病发病率<15.0% (对照的发病率为68.3-80.0%),植株干重增加37.5-48.1%。SQR-T037代谢的拮抗物质6PAP能够抑制FOC,从而能够控制黄瓜连作地的枯萎病。采用 PCR-DGGE ( Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)的方法测定连作土壤使用SQR-T037对黄瓜根际微生物区系的影响,结果表明SQR-T037显著(p<0.05 )影响黄瓜根际土壤的微生物区系组成(细菌和真菌),SQR-T037处理的微生物多样性指数(Shannon-Weaver index)显著高于对照处理(细菌和真菌多样性指数分别高于对照17.1%和41.2%)。黄瓜根际土壤中可培养微生物数量测定显示,SQR-T037处理土壤放线菌数量和对照没有显著差异,但是细菌和真菌的数量显著(p<0.05 )高于对照,尖抱镰刀菌绝对数量及其占可培养微生物总量的比例显著低于对照。SQR-T037处理黄瓜枯萎病的发病率和根际土壤化感物质的浓度均显著低于对照,而植株干重高于对照。接种SQR-T037能够多样化黄瓜连作土壤的微生物区系,增加微生物总量,减少病原菌数量。SQR-T037不同的施用模式对人工接种FOC 土壤黄瓜枯萎病的生防效果的测定表明:SQR-T037的孢子悬液(TCS)、有机肥吸附(TBF)和固体发酵有机肥(TFF)的三种模式中,固体发酵有机肥效果最好,有机肥吸附的模式次之,孢子悬液的生物防治效果最差。相同的生防模式对于黄瓜土传枯萎病的防治效果随着其中有效的SQR-T037的数量的增加而增加。三种不同的施用模式在将黄瓜枯萎病发病率控制在低于30%的水平的时候,其有效的SQR-T037的数量不同。TCS和TBF模式有效的使用浓度为SQR-T037 106 CFUkg-1 土壤,而TFF模式只需要105 CFUkg-1 土壤就能够将黄瓜枯萎病控制在8.9%以下。通过实时荧光定量PCR (Real-Time PCR)技术测定土壤中SQR-T037的数量,结果表明有机肥作为基质载体有利于SQR-T037在黄瓜的根际和土体土壤中定殖,同样也有利于SQR-T037对F.oxysporum的抑制。对有效控制黄瓜枯萎病的三个处理TCS (106)、TBF (106)和TFF (106)的抗病性相关指标测定表明,在诱导黄瓜抗病性能力上:TFF (106)效果最好,TBF (106)次之,TCS (106)较弱。SQR-T037生防最好的施用模式是固体发酵有机肥(TFF)。通过向牛粪中添加稻草秸秆和醋糟作为培养基质、接种SQR-T037、结合统计学方法优化,固体发酵生产具有较高SQR-T037生物量和6PAP产量、且具有高效生防黄瓜连作枯萎病功能的微生物有机肥。结果显示,通过部分因子析因实验(fractional factorial design)得知,SQR-T037接种量(%, v/w)、秸秆添加量(%,w/w)、醋糟添加量(%, w/w)、发酵温度(T)、发酵天数(d)和搅拌频率(d)等6个因素中,SQR-T037接种量、醋糟添加量、发酵天数和发酵温度对SQR-T037生物量和6PAP产量具有显著(p<0.05 )影响。进一步的运用中心组合法(Composite Central Design)对四个显著影响因子最佳区间优化得到SQR-T037生物量最大、6PAP产量最大和SQR-T037生物量+6PAP产量都最大的三种区间条件。三种条件都获得了进一步的验证且都趋近于预测值。通过对三种条件生产的微生物有机肥的生防效果比较得知,生产条件为发酵天数36.7d、发酵温度25.9℃、接种量7.6%和醋糟添加量41.0%所生产的微生物有机肥具有最高的生防效果,其SQR-T037生物量为8.5 Log10 ITS copies g-1干重,6PAP产量为1291.7mg kg-1干重。微生物有机肥有效物质S(SQR-T037和6PAP在保存期内虽然有所降低但是仍然维持在较高的水平。SQR-T037固体发酵有机废弃物产品防治黄瓜连作枯萎病对于高附加值化处理固体废弃物和克服经济作物连作障碍有很重要的意义。SQR-T037微生物有机肥(BIO)营养钵育苗和大钵移栽土壤(模拟田间)施用对黄瓜连作土壤中SQR-T037和F. oxysporum 在植株根际的定殖、根际土壤中化感物质的降解、土壤微生物区系的修复以及枯萎病的生物防治研究显示,1% (w/w) BIO营养钵育苗(N处理)和BIO营养钵育苗结合大钵移栽土壤施用(N+T处理)的方式都能显著(p<0.05)控制黄瓜枯萎病。在对照处理枯萎病的发病率为72.2%的情况下,N处理和N+T处理能够将发病率分别控制在25.4%和15.1%的水平。N处理和N+T处理显著(p<0.05)增加黄瓜植株干重,而且N+T处理增重效果高于(p<0.05) N处理。对于根际SQR-T037和F.oxysporum 数量的研究表明,N处理和N+T处理均能够显著增加根际SQR-T037的数量;相较于N处理,N+T处理对于增加根际土壤的SQR-T037数量效果更显著(p<0.05)。相较于对照,N处理和N+T处理均能够抑制根际土壤和根表的F.oxysporum数量,但是N处理不利于抑制F.oxysporum 在根际土壤的定殖,只有营养钵和大钵移栽土壤结合施用BIO的N+T处理才能够显著(p<0.05 )抑制F. oxysorum在根际土壤和根表定殖。N处理对于土壤可培养细菌和放线菌数量没有显著影响,而N+T处理显著(p<0.05 )提高三种可培养微生物的数量。N处理和N+T处理均能够在黄瓜移栽的第8天和30天显著(p<0.05)提高黄瓜的几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶和多酚氧化酶活力。相较于N处理,N+T处理在黄瓜移栽第35天的时候,几丁质酶和β-l,3-葡聚糖酶表现出更高(p<0.05)活性。通过PCR-DGGE技术对黄瓜根际土壤木霉菌、真菌和细菌的区系研究表明,相较于对照处理,不同处理均能提高黄瓜连作土壤的微生物多样性指数,其中N+T处理效果最好,其木霉菌、真菌和细菌多样性指数均高于非连作健康土壤(p<0.05 )。通过对不同处理的DGGE图谱的聚类分析显示,N+T处理土壤木霉菌区系组成与非连作健康土壤接近,而N处理与对照处理相近。非连作健康土壤处理与对照处理土壤真菌区系组成相近,而添加BIO处理的土壤真菌区系组成相近;主成分分析表明,对照处理和N+T处理以及对照处理和非连作健康土壤处理真菌区系组成差异较大(34.9%+20.7%)。土壤细菌区系聚类分析表明,N处理、N+T处理以及非连作健康土壤处理之间的区系组成相近,而对照与该三个处理相似性较远。主成分分析显示,对照处理和N+T处理,以及N处理与N+T处理之间的差异都较大(35.0%+23.0%)。对照处理根际土壤中能够检测到对羟基苯甲酸、苯甲酸和肉桂酸等3种酚酸,其浓度分别为7.5、1.8和14.0 μgkg-1干土;N处理和N+T处理均检测不到酚酸类物质。通过BIO营养钵育苗结合大钵移栽土壤施用能够有效控制黄瓜连作土传枯萎病和恢复连作土壤微生物区系多样性。SQR-T037 BIO对黄瓜连作枯萎病防效和增产效果的田间试验显示,BIO处理能够把连作土壤枯萎病从对照平均发病率18.6%降低到3.5%,生物防治率为81.2%;黄瓜平均产量从对照102.50tha-1增加到BIO处理的123.75tha-1,增产达20.7%。SQR-T037 BIO能够有效控制黄瓜连作土传枯萎病。