前言信号转导与转录激活因子(Signal Transducer and Activator of Transcription,STAT)蛋白家族是存在于胞浆内并能被细胞外多脂与其膜受体结合而激活的信号转导蛋白家族。越来越多的证据表明:除了生理作用外,STAT蛋白还与肿瘤的发生有密切的关系,特别是STAT3,在不同类型的恶性肿瘤中均可见其处于持续活化的状态。STAT蛋白的活化可以引起与细胞增殖、分化及发育等细胞功能调控密切相关的基因表达。文献报道葫芦素B(Cu B)可以显著降低多种肿瘤细胞中STAT3磷酸化水平,并抑制肿瘤细胞的生长。有关葫芦素B对肝癌的作用及其作用机制的研究尚未见详细报道。本研究应用MTT法、流式细胞术、荧光显微镜、Western blot以及裸鼠异种移植等方法,研究了葫芦素B在体内外对肝癌细胞的抑制作用及其可能的作用机制。材料与方法一、用四氮唑蓝比色法(MTT法)检查细胞增殖HepG-2细胞制成细胞悬液按100μ1/孔加至96孔板内,使每孔内细胞数为5000。24小时后加入含10%FBS的RPMl1640培养液稀释的药物,包括不同药物试验组及溶剂阴性对照组。检测药物作用24、48、72小时后的细胞增殖抑制率,每次实验每个浓度药物设三个重复孔,实验重复3次。二、细胞形态学观察HepG-2细胞经0.01μM、0.1μM、1μM葫芦素B作用24小时后,光镜下观察实验组、对照组细胞形态学改变。三、Hoechst 33258荧光染色观察细胞核形态变化HepG-2细胞5×10~5/孔置于放有盖玻片的6孔板内培养,24小时后加入不同浓度的葫芦素B。药物作用24小时后,4℃用PBS洗涤细胞,甲醇/乙酸(3/1,v/v)固定液固定细胞15分钟,最后用Hoechst 33258荧光染料避光染色30分钟,于荧光显微镜下观察,照像。四、流式细胞术检测细胞周期变化HepG-2细胞以每孔1×10~6/孔接种至6孔板内,贴壁过夜后分别加入不同浓度的葫芦素B。药物作用一定时间后,0.25%胰酶消化收集细胞,7O%乙醇4℃固定细胞过夜。用100 mg/ml PI(含50μg/ml RNA酶)溶液避光染色细胞后用流式细胞仪进行细胞周期检测。五、Annexin—V/PI双标记法检测细胞凋亡HepG2细胞1×10~6/孔接种于六孔培养板中过夜,用不同浓度药物及溶剂处理细胞,24小时后收集细胞,预冷PBS离心洗涤2-3次。将细胞重悬于250μl结合缓冲液,加入10μl Annnexin-V-FITC和5μl PI,轻轻混匀,室温避光反应30分钟后用流式细胞仪检测。六、蛋白免疫印记实验(Western Blot)全细胞蛋白提取物以100μg/孔加样后用10%SDS-PAGE分离蛋白,然后将PAGE凝胶中的蛋白转移至硝酸纤维素膜,5%脱脂牛奶阻断。加入p-STAT3一抗与蛋白结合,然后结合相应的二抗。同时以β-actin作为上样量参比。用ECL显色检测结合的蛋白。七、裸鼠移植瘤的抗肿瘤活性检测收获的HepG-2细胞制成生理盐水细胞悬液,每只裸鼠(雌性)双侧接种细胞5×10~6。当肿瘤生长至300 mm~3时,接种于另外的裸鼠体内进行体内传代。两次传代后当肿瘤体积长至300 mm~3后按照传代方法接种裸鼠50只。当平均肿瘤大小约为100 mm~3时,取生长较均一的36只荷瘤鼠随机分6组(每组6只鼠),设立溶剂对照组(生理盐水)、葫芦素B高剂量组(110 u g/kg/d)、葫芦素B中剂量组(55μg/kg/d)、葫芦素B低剂量组(27.5μg/kg/d)、阳性对照组(5-FU 20 mg/kg,隔日给药)。实验期间给药前测量肿瘤长径、短径用以计算肿瘤体积。八、统计学处理本实验统计采用SSPS13.0软件包进行统计分析。数据采用均数±标准差表示,采用t检验评价统计学显著性差异,p≤0.05表示有统计学意义。结果一、葫芦素B对HepG-2细胞增殖及活性的影响用0.01-100μM葫芦素B处理HepG-2细胞,分别于24h、48h、72h后终止实验,MTT比色测其增殖抑制率。结果显示随着时间和浓度的增加,葫芦素B对HepG-2细胞的抑制作用增强。二、细胞形态学观察HepG-2细胞经0.01μM、0.1μM及1μM葫芦素B作用24h后,光镜下观察:对照组细胞生长良好,0.01μM葫芦素B作用后的细胞生长缓慢,细胞数量减少,细胞间隙变宽,部分细胞形态变圆、变亮,可见少量细胞裂解碎片;1μM葫芦素B作用后的细胞数量明显减少,全部细胞形态变圆、变亮,可以见到大量细胞裂解碎片。三、细胞核形态变化葫芦素B处理HepG-2细胞24h后,从0.1μM浓度开始,细胞核形态发生明显的凋亡性改变,呈现染色质浓缩、核片断化,伴随凋亡小体形成。凋亡细胞的增加呈现浓度和时间依赖方式。四、葫芦素B对HepG-2细胞周期和凋亡的影响流式细胞仪检测表明葫芦素B可以引起HepG-2细胞的S期阻滞,0.1μM、1μM、10μM葫芦素B作用于HepG-2细胞24h后S期细胞比例分别为30.3%-42.0%(溶剂对照组为24.1%);10μM葫芦素B作用于HepG-2细胞0h、4h、8h、24h后也可以引起HepG-2细胞相似的变化(21.9%-43.3%)。Annexin-V/PI染色检测显示葫芦素B可以引起细胞凋亡,1μM、10μM葫芦素B作用于HepG-2细胞24h后的细胞凋亡率分别为26.8%和35.2%(溶剂对照组为6.5%)。五、蛋白质印迹检测p-STAT3蛋白水平的表达不同浓度及时间葫芦素B作用后的HepG-2细胞中p-STAT3蛋白水平的表达结果显示随着药物作用的浓度(≥1μM)及时间(≥4h)的增加,p-STAT3蛋白水平的表达逐渐降低。六、葫芦素B抑制肝癌细胞HepG-2裸鼠移植瘤生长实验结束时,27.5、55、110μg/kg/d葫芦素B治疗组的肿瘤平均体积为436±82mm~3(P＜0.05)、309±109 mm~3(P＜0.01)和202±33 mm~3(p＜0.01),明显小于空白对照组(532±104 mm~3);5-FU对照组平均体积为227±39 mm~3。葫芦素B治疗的3个剂量组之间肿瘤体积存在显著差异(P＜0.05或0.01),提示其对肝癌移植瘤的抑制作用具有剂量依赖性。讨论许多研究表明葫芦素B在体内和体外对多种人肿瘤细胞的增殖具有抑制作用。本研究用不同浓度的葫芦素B处理人肝癌细胞HepG-2一定时间后的结果(MTT及体内实验)显示葫芦素B对HepG-2细胞有明显的增殖抑制作用,并且其作用呈剂量和时间依赖性。为了进一步阐明葫芦素B对HepG-2细胞作用的机制,我们采用了细胞周期分析、Hoeehst 33258核染色、细胞核形态观察以及Western Blot分析等实验方法。葫芦素B以时间和浓度依赖的方式引起细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡。细胞形态发生明显的改变,细胞核发生凋亡性改变,包括染色质聚集、核片断化,并伴随凋亡小体形成。葫芦素B可以降低HepG-2细胞STAT3蛋白的磷酸化水平。综上所述,葫芦素B在体内外对HepG-2细胞具有生长抑制作用,其作用机理可能为引起细胞周期阻滞,同时诱导肝癌细胞凋亡,其分子机制可能与葫芦素B抑制了STAT3蛋白的活性有关。结论本实验结果表明,葫芦素B在体内、外均对人肝癌细胞系有抑制作用。其抑制作用是通过细胞周期阻滞和诱导凋亡引起的。该实验结果为将来葫芦素B应用于临床提供了理论依据。