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寡孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)是一种捕杀线虫的丝状真菌,它通过产生捕食器官(捕器)—三维菌网捕捉线虫。前期的研究发现氨基酸或小肽能够诱导A.oligospora产生捕器,最近本课题组也报道了尿素能诱导A.oligospora等捕食线虫真菌产生捕器,说明氨基酸等氮源可以调控捕器的形成。为了进一步了解氨基酸调控捕食线虫真菌产生捕器的分子机制,以A.oligospora菌株为研究对象,选取了与氨基酸信号调控密切相关的蛋白雷帕霉素靶蛋白(TOR,target of rapamycin)信号途径相关的 3 个蛋白(AOL_s00043g12、AOL_s00079g187、AOL_s00097g622)、一般性调控阻遏蛋白激酶 2(Gcn2,AOL_s00215g639-18)和2 个 G 蛋白偶联受体(GPCR)(AOL_s00054g626 和 AOL_s00079g452)作为目标蛋白,通过基因敲除,分析它们在A.oligospora生长发育和捕器形成过程中的功能,探讨氨基酸信号调控寡孢节丛孢产生捕器的机制。主要实验结果:1.Tor和Gcn2等基因敲除载体的构建、转化和筛选。选用同源替换法构建靶基因的敲除载体,利用CaCl2-PEG转化法将构建的各个敲除基因载体分别转化到寡孢节丛孢(AO)原生质体,成功得到6个基因的转化菌株,包括 Δ12-27、Δ187-1、Δ187-5、Δ622-15、Δ639-18、Δ626-65和Δ452-94等阳性转化子。2.野生型AO和突变菌株的表型比较。对转化子和野生菌株的生长速率、抗逆性、产孢能力及其孢子形态进行了比较,结果显示:各个突变株与野生株在不同培养基上生长速率差异不大;在抗逆性方面,除了Δ626-65与野生菌株差异稍微明显外,其他突变株与AO差异不太明显;在产孢方面,在孢子形态上相比较没有明显差异,对于孢子数量而言,Δ626-65和Δ639-18两株菌的产孢量明显高于AO;Δ187-5和Δ622-15的产孢量略高于AO;Δ452-94敲除株产孢量少于AO;而Δ12-27产孢量与AO差别不大,说明以上靶基因敲除后不影响AO的生长和孢子的形态,但部分基因对产孢能力有显著的影响。3.活线虫、尿素和氨基酸诱导AO和突变株产捕器比较。主要结果包括三个方面:1)用活线虫诱导各菌株产捕器,Δ626-65和A639-18产生捕器数目明显多于野生株,而A12-27、Δ187-5、Δ622-15、Δ307-2和Δ452-94产生捕器的数目低于野生株。2)用10 g/100 ml无菌尿素溶液诱导AO和各个突变菌株,发现各个菌株或多或少都能产生捕器。野生株及其敲除株在36 h开始产捕器(除A187-5在60h时才开始产生捕器),在72h时所有菌都能产生大量捕器。3)利用不同浓度的缬氨酸(Val)(0.5g/L,0.05g/L,0.005 g/L)诱导AO和各敲除株产捕器,发现将Tor和Gcn2基因敲除后,突变株几乎不产生捕器;而不同浓度的缬氨酸溶液均能诱导AO及Δ626-65产生捕器,随着浓度的降低,捕器数目也有所降低;不同浓度下AO产生捕器数目远远高于A626-65。说明TOR和Gcn2与AO产捕器调控密切相关。本论文创新点:1.成功敲除了 AO基因组中Tor、Gcn2和Gpcr 6个基因,对野生型AO和突变菌株的表型特征进行了比较,初步推测它们在AO生长发育过程中的作用。2.缬氨酸(Val)对AO野生菌株和突变菌株产捕器的诱导能力进行了比较,发现Gcn2、Tor(3个)和Gpcr基因AOL__s00079g452被敲除后,不能在Val诱导下产生捕器,而AO野生株和Gpcr基因AOL_s00054g626敲除株能在Val诱导下产生捕器;说明TOR和Gcn2与AO产捕器调控相关。