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共轭亚油酸（Conjugated linoleic acid,CLA）因为具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等功效而对人体的健康具有重要作用。目前人们主要从乳制品和肉制品中获取CLA,但乳制品和肉制品中CLA的含量非常低,无法满足人们的营养健康需求。微生物被报道可以大量转化生成CLA,且微生物转化生成的CLA具有异构体单一、周期短等特点,可成为未来大量获取CLA的一个重要的途径,其中具备生物转化CLA能力的双歧杆菌由于其可以有效的促进宿主健康而备受关注。虽然已有大量文献证实了双歧杆菌具备生物转化CLA的能力,但双歧杆菌生物转化生成CLA的具体转化路径、功能基因及其调控机制却一直未被解析。为了阐述双歧杆菌生物转化CLA的路径及调控机制,本研究通过转录组学、基因外源表达、基因敲除等手段对其进行了系统的研究,旨在为高产CLA双歧杆菌的工业化应用提供理论依据和技术支持。本文首先对169株双歧杆菌生物转化CLA以及10-羟基-顺12-十八碳烯酸（10-HOE）的转化率进行了检测和比较,分析并总结了双歧杆菌生物转化CLA和10-HOE的种属规律,筛选得到了生物转化CLA产率最高的短双歧杆菌CCFM683。接着通过同位素13C标记法明确了双歧杆菌CCFM683生成CLA的具体转化途径。进一步通过转录组学、加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-Expression Network Analysis,WGCNA）以及其他分子生物学技术确认了菌株生物转化CLA过程中的关键基因,并探究了该酶在菌株应对亚油酸胁迫过程中的具体作用形式。最后通过基因沉默等分子生物学技术明确了调控该过程关键基因转录的调控蛋白及其调控机制。本研究主要结果如下:（1）明确了双歧杆菌生物转化CLA及10-HOE的种属规律,并且确认了LA转化生成CLA和10-HOE的基本转化路径。首先通过比较169株来源于人体粪便的双歧杆菌生物转化生成CLA及10-HOE的转化率,结果显示短双歧杆菌生物转化CLA的能力最强,其次为假小链双歧杆菌、长双歧杆菌以及齿双歧杆菌,其中短双歧杆菌CCFM683的转化率最高（90.30%）。而两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、角双歧杆菌中未分离出具备生物转化CLA能力的菌株。此外,以上8个种的双歧杆菌均具备生物转化生成10-HOE的能力,其中以假小链双歧杆菌CCFM749的10-HOE转化能力最高（39.09%）。此外,本研究还发现LA及10-HOE均可作为短双歧杆菌CCFM683生物转化生成CLA的底物,其中LA可以直接转化生成CLA,而10-HOE需先经过亚油酸水合酶（MCRA）作用转化生成LA,LA再进一步转化生成CLA。（2）确认了短双歧杆菌CCFM683中催化CLA转化的关键基因为亚油酸异构酶基因。本文首先以稳定同位素13C标记的LA作为底物,并通过GC-MS对最终含有13C标记的生成物进行检测以进一步对其转化途径进行分析,研究结果发现CCFM683将LA转化生成CLA的过程中并未检测到其他中间产物,由此可确认LA转化生成CLA为单步反应。转录组学数据显示CCFM683转化LA生成CLA过程中基因的转录水平发生显著变化（p<0.05）;WGCNA结果显示编号为CCFM683GM001103,CCFM683GM001531的两个未知功能的基因可能是编码亚油酸异构酶的基因。而基因外源表达以及酶学实验结果显示编号为CCFM683GM001103的基因编码的蛋白（命名为短双歧杆菌亚油酸异构酶（Bifidobacterium breve isomerase,BBI））具有催化LA生成CLA的活性。BBI蛋白含有9个跨膜结构,该酶的功能是首次被报道,并且是目前细菌中唯一被报道的能够单酶催化LA生成cis9,trans11-CLA单体的亚油酸异构酶。此外,BBI蛋白只能利用游离态的LA作为底物转化生成CLA,而不能催化非游离态的LA生成CLA;并且该酶更倾向于利用诸如含有至少两个双键的LA、亚麻酸（Linolenic acid）等作为底物,而不能利用诸如油酸（Oleic acid,OA）、硬脂酸（Stearic acid,SA）等只含一个或不含双键的底物,且各底物的转化效率高低依次为α-亚麻酸（alpha-linolenic acid,ALA）>LA>γ-亚麻酸（gamma-linolenic acid,GLA）。（3）短双歧杆菌CCFM683中亚油酸异构酶（BBI）与亚油酸水合酶（MCRA）对于菌株耐受游离态LA的胁迫具有非常重要的作用。研究结果显示敲除亚油酸异构酶基因bbi会导致CCFM683在含LA（0.5 mg/m L）培养基中的生长受到明显抑制,而回补bbi基因会使菌株耐受LA的能力得以恢复。此外,沉默亚油酸水合酶基因mcra也会使菌株耐受LA的能力下降,以上结果表明亚油酸异构酶（BBI）及亚油酸水合酶（MCRA）在短双歧杆菌CCFM683应对游离LA胁迫过程中起到非常关键的作用。进一步我们通过差速离心获得不同部位的蛋白并结合免疫印迹法（western blot）证实了BBI蛋白存在于细胞质膜上,MCRA蛋白存在于细胞质中。通过分析短双歧杆菌CCFM683胞内外LA、CLA和10-HOE的动态变化,推测出亚油酸异构酶的催化过程可能是直接将胞外的LA转化生成CLA,而MCRA则可能是将渗入至细胞质内的LA转化生成了10-HOE。（4）短双歧杆菌CCFM683中转录调控蛋白Clg R同时调控亚油酸异构酶基因bbi以及亚油酸水合酶基因mcra的转录过程。研究结果显示过表达clgr基因可以同时提高短双歧杆菌CCFM683中bbi和mcra基因的转录水平,并提高菌株耐受游离态LA胁迫的能力。干扰clgr基因的转录会同时降低bbi以及mcra基因的转录水平,并降低菌株耐受游离态LA胁迫的能力。凝胶迁移实验（Electtrophoretic mobility shift assay,EMSA）结果进一步显示Clg R蛋白可以特异性结合bbi以及mcra上游调控序列,由此可见Clg R蛋白可以同时调控bbi以及mcra基因的转录。蛋白质二级结构分析显示Clg R蛋白共含有5个α螺旋,其中第4个α螺旋（N端至C端方向）负责与bbi和mcra基因上游序列的结合。bbi基因上游调控区域与Clg R蛋白结合的位点为G（7）--G---GCG-----TAG--CG--C（32）,而mcra基因上游调控区域与Clg R蛋白结合的位点为G（7）--G------GCACA------TAT----CG（34）。综上可知,转录调控蛋白Clg R可以直接调控短双歧杆菌CCFM683中中bbi以及mcra基因的转录以应对游离态LA对菌株的胁迫。（5）亚油酸异构酶（BBI）和亚油酸水合酶（MCRA）分别与双歧杆菌生物转化CLA和10-HOE能力之间存在关联性。生物信息学分析表明,能够生物转化CLA的短双歧杆菌、长双歧杆菌、假小链双歧杆菌、齿双歧杆菌中均存在BBI蛋白,但是含有BBI蛋白的菌株不一定都具备生物转化CLA的能力,比如短双歧杆菌AHWH9M5等;而不具备生物转化CLA能力的两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌、动物双歧杆菌及角双歧杆菌中均不存在BBI蛋白。同样的,双歧杆菌中MCRA蛋白与菌株生物转化10-HOE的能力存在关联性,生物信息学数据表明具备生物转化10-HOE能力的双歧杆菌中均存在MCRA蛋白,但是含有MCRA蛋白的菌株不一定具备生物转化10-HOE的能力。