根毛和花粉管内微丝及肌球蛋白的分布与作用研究

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植物细胞中的根毛和花粉管是典型的具有高度极性和快速顶端生长的细胞,其内部存在旺盛的胞质环流,因此是研究植物细胞骨架与细胞器运动的重要模式材料。目前,基于研究方法的不同,根毛细胞和花粉管顶端及亚顶端微丝的排布形式还存在一些值得商榷的地方,而相应顶端的分泌囊泡是如何运输到质膜也有待深入研究。本研究对稳定表达GFP-ABD2-GFP的拟南芥根毛及稳定表达ABD2-GFP和GFP-ABD2-GFP的烟草花粉进行了研究,并观察其内微丝骨架的分布。观察发现在生长不同时期的根毛细胞和花粉管顶端透明区前,均普遍存在高度动态变化的环绕微丝束。通过MitoTracker Red CMXRos染色标记线粒体,发现线粒体沿着环绕微丝束在根毛细胞亚顶端和花粉管亚顶端发生转向运动;进一步用肌球蛋白抑制剂BDM处理5分钟后,观察发现线粒体运动几乎停止。这些结果说明环绕微丝束是线粒体在根毛和花粉管亚顶端转向运动的轨道,而这种运动是由肌球蛋白驱动的。有关研究有助于加深人们对植物顶端生长细胞内细胞器转向及双向运动机理方面的理解。其次,在共焦激光扫描显微镜下观察稳定表达ABD2-GFP和GFP-ABD2-GFP的烟草花粉管,我们发现在花粉管顶端还存在从环绕微丝束分支出来向顶端延伸的细的微丝网络;这种顶端微丝网络,随着花粉管的生长始终存在。低浓度的微丝解聚剂Lat B处理,会导致花粉管顶端微丝网络迅速解聚消失,使粗微丝束延伸向顶端,并导致花粉管停止生长;用相同浓度的Lat B处理稳定表达VAMP725-GFP的烟草花粉管(VAMP725是分泌囊泡的标记蛋白),发现VAMP725-GFP顶端聚集分布的倒三角形迅速消失;这两个结果说明花粉管顶端的微丝网络对其生长起重要作用,它可能参与分泌囊泡运输到顶端进行膜融合的过程。此外,我们对在拟南芥成熟花粉中大量表达的肌球蛋白Atmyosin XI-C和 Atmyosin XI-E的T-DNA插入突变体,进行了纯合体鉴定和表型观察分析。体外萌发观察发现,Atmyosin XI-C的两个T-DNA插入突变体花粉管长度和生长速率与野生型的花粉管长度和生长速率没有明显差别;而Atmyosin XI-E的两个T-DNA插入突变体花粉管长度明显短于野生型的,其生长速率也明显慢于野生型花粉管;对Atmyosin XI-E的两个T-DNA插入突变体花粉管体内生长的观察,也发现其比野生型花粉管体内生长速率要慢一些,说明Atmyosin XI-E的突变影响了拟南芥花粉管的生长。进一步观察发现,Atmyosin XI-E的T-DNA插入突变体的花粉管最终也能完成受精作用,其角果形态、种子形成和结实率与野生型相比都没有明显差异。进而,我们对肌球蛋白XI-E进行尾部抑制实验;即将其N端与微丝作用的头部区截取掉,保留包括IQ区之后的尾部区域,与mCherry构成融合蛋白(mCherry-EIQ tail),并进行烟草花粉的基因枪转化实验。结果显示,与对照相比,mCherry-EIQ tail融合蛋白表达后,烟草花粉管生长受到明显抑制。进而,在稳定表达VAMP725-GFP的烟草花粉中瞬时转化mCherry-EIQ tail,发现VAMP725-GFP的顶端聚集呈倒三角形的分布特点消失,并且花粉管停止生长;对VAMP725-GFP进行FRAP实验,发现花粉管顶端荧光恢复缓慢;我们又将mCherry-EIQ tail和RLK-GFP(RLK是指示质膜融合的标记蛋白)进行基因枪双转化,然后对RLK-GFP进行FRAP实验,发现花粉管顶端以及质膜上的荧光基本无法恢复,而花粉管也停止了生长。以上结果说明mCherry-EIQ tail的表达,严重抑制了花粉管的生长,影响了分泌囊泡的正常分布,并抑制了囊泡向顶端运输发生膜融合的过程。因此,我们推测myosin XI-E可能是沿花粉管顶端微丝网络,将囊泡运输到顶端并发生膜融合的马达蛋白之一。
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