【摘 要】
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赭曲霉毒素A（OTA）是一种广泛污染于粮食作物和食品中的的真菌毒素,是近年食品安全领域关注的风险因子之一。OTA具有肾毒性,肝毒性,免疫毒性和致畸致癌作用,其中肾脏是OTA最主要的靶器官。关于OTA肾毒性机理的研究很多,但关于OTA对人胚肾细胞HEK 293周期分布和DNA损伤影响的研究目前还未见报道。本文通过研究OTA对HEK 293细胞周期分布和DNA损伤的影响,进一步完善了 OTA的肾毒性机
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赭曲霉毒素A（OTA）是一种广泛污染于粮食作物和食品中的的真菌毒素,是近年食品安全领域关注的风险因子之一。OTA具有肾毒性,肝毒性,免疫毒性和致畸致癌作用,其中肾脏是OTA最主要的靶器官。关于OTA肾毒性机理的研究很多,但关于OTA对人胚肾细胞HEK 293周期分布和DNA损伤影响的研究目前还未见报道。本文通过研究OTA对HEK 293细胞周期分布和DNA损伤的影响,进一步完善了 OTA的肾毒性机理。本论文主要研究结果与结论如下:1.OTA处理HEK 293细胞显著抑制细胞增殖,引起活性氧上升,膜电势下降,且与浓度成正相关,表明OTA会引起HEK293细胞发生氧化损伤。通过彗星实验发现,OTA处理HEK 293细胞24 h后,其彗星拖尾率,尾距,尾部DNA等参数都显著高于对照组,表明OTA引起HEK293细胞DNA链断裂。通过流式细胞术检测发现,OTA处理能引起HEK293细胞发生S期阻滞,同时OTA引起与S期相关的三个关键蛋白cyclin A2,cyclin E1和CDK2的下调。2.N-乙酰半胱氨酸（NAC）预处理减轻了 OTA对HEK 293细胞增殖的抑制作用,减缓了OTA引起的氧化损伤,与OTA处理组相比,活性氧水平明显降低,膜电势明显上升,SOD活力明显提升。彗星实验结果显示NAC预处理明显减轻了 OTA引起的DNA损伤现象。HPLC/MS/MS测定结果显示NAC预处理缓解了 OTA引起的DNA的氧化损伤,使8-OHdG水平有所下降,总体甲基化水平有所恢复。通过添加NAC预处理,明显缓解了 OTA引起的周期阻滞现象,S期相关的三个关键蛋白cyclin A2,cyclin E1和CDK2在mRNA水平和蛋白水平表达量均有所回升。3.硫酸锌（ZnSO4）和OTA共同孵育减轻了 OTA对HEK 293细胞增殖的抑制作用,抑制OTA引起的活性氧的产生,同时使膜电势和SOD活力回升,充分显示了ZnSO4的抗氧化作用。彗星实验结果显示ZnSO4能缓解OTA引起的DNA链断裂。添加ZnSO4能减少8-OHdG的形成,总体甲基化水平有所提高,表明锌起到稳定DNA的作用。4.成功构建了 Chk1超表达质粒pcDNA3.1（+）-Chk1,转染细胞系与对照细胞系相比,Chk1蛋白表达效率明显提升。成功构建了 Chk1干扰质粒pEGFP-H1-Chk1-shRNA,转染细胞系与对照细胞系相比,Chk1蛋白表达效率明显下调,为进一步明确Chk1在OTA引起的周期阻滞中发挥的作用提供体外模型。
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