论文部分内容阅读
目的：原发性肝细胞癌(primary hepatocellular carcinoma, HCC),是我国最常见的恶性肿瘤之一,具有高发病率和高死亡率特点。因此,研究肝癌发生发展的分子机制,对提高肝癌治疗疗效有重要的临床指导意义。高迁移率族蛋白2(high-mobility groupA2, HMGA2)是一种非组蛋白染色体蛋白,在多种肿瘤中高表达,并与肿瘤预后密切相关,但在肝癌中的作用并不清楚。microRNA分子是一类非编码小RNA, let-7g作为microRNA分子一员,通过与靶基因3’非编码翻译区(3’UTR)结合抑制靶基因的转录或翻译,调控许多基因的表达。在肝癌中尚未见let-7g对HMGA2调控的研究。在本次研究中,我们首先检测HMGA2和let-7g在肝癌组织及肝癌细胞中的表达情况并分析两者的相关性,分析HMGA2蛋白的表达与肝癌临床病理参数及预后之间的关系；探讨转染let-7g mimics提高细胞内let-7g表达水平对HMGA2表达的影响,对肝癌细胞株HepG2生物学活性的影响,并进一步研究其下游作用机制。方法：(1)收集新鲜肝癌组织及其配对的癌旁组织,肝癌细胞系并收集肝癌石蜡切片及其配对的癌旁组织。行实时荧光定量PCR (Real-time qPCR)检测HMGA2mRNA. let-7g在肝癌组织、肝癌细胞的表达水平,分析两者在肝癌组织中的相关性。行免疫组化检测HMGA2蛋白在肝癌中表达情况,分析]3MGA2蛋白表达与肝癌临床病理因素及肝癌预后之间的关系。(2)合成let-7g mimics并瞬时转染HepG2细胞。Real-time qPCR检测转染后细胞内let-7g表示水平,再行Real-time qPCR和western blot检测上调let-7g表达后对HMGA2表达的影响；行双荧光素酶报告基因实验检测let-7g对HMGA2的靶向调节作用。分别运用MTT法、流式细胞术和Transwell法检测表达上调后let-7g对细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响。(3) Real-time qPCR和western blot检测上调let-7g表达后细胞内p16基因表达情况。结果：(1)HMGA2mRNA在肝癌组织的表达明显高于其癌旁组织中的表达；在肝癌细胞HepG2, HuH-7是高表达的,在肝细胞L02是低表达的；HMGA2在肝癌组织的表达与let-7g负相关。(2)HMGA2蛋白在肝癌组织阳性表达率明显高于癌旁组织；HMGA2蛋白的表达与肝癌的大小、血管及包膜侵犯正相关,与肝癌预后负相关。(3)通过转染let-7g mimics上调HepG2细胞内let-7g的表达水平,let-7g在转录和翻译水平抑制了HMGA2的表达,通过双荧光素酶报告基因实验证实HMGA2是let-7g靶基因。(4)上调细胞内let-7g表达水平可抑制细胞增殖、抑制细胞迁移和侵袭、促进细胞凋亡。(5)上调细胞内let-7g表达水平后,细胞中p16基因的表达水平是升高的,let-7g可通过抑制HMGA2表达,上调p16的表达。结论：(1)HMGA2在肝癌组织中高表达,HMGA2蛋白的表达与肝癌的大小、血管侵犯、包膜侵犯正相关,与预后呈负相关；HMGA2可能与肝癌的发生、发展密切相关,并可作为判断肝癌预后指标之一。(2)let-7g靶向抑制]HMGA2转录和翻译,HMGA2是let-7g的靶基因之一。(3)过表达let-7g通过靶向作用于HMGA2,抑制肝癌HepG2细胞的增殖、侵袭和转移能力并促进细胞凋亡,let-7g可能在肝癌中具有抑癌作用。(4) let-7g可通过靶向抑制HMGA2表达,上调p16表达抑制肝癌细胞增殖。