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磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine, PC)不仅是构成生物膜的重要成分,还是脂类合成的重要酰基供体以及植物细胞中脂肪酸修饰作用(如去饱和作用、羟基化)不可替代的底物。PC sn-2位点的酰基不断地发生着去酰基化反应和再酰基化反应,使PC快速地翻转和再修饰,该过程被称为"Land cycle"。溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(lysophosphatidylcholine acyltransferase, LPCAT)是"Land cycle"中的一个关键酶,它主要催化溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine, LPC)酰基化形成PC。通过调控掺入PC sn-2位点的酰基种类,LPCAT能影响PC的脂肪酸组成和特性,也能影响PC和酰基库之间的酰基交换。已有研究指出LPCAT参与的酰基交换在三酰甘油(triacylglycerol, TAG)合成中起重要作用。因此,研究LPCAT在酰基交换中的作用机理,对改造植物中脂肪酸成分,特别是非常规脂肪成分,具有十分重要的意义。本研究中,我们利用异源LPCAT互补功能缺失的酵母突变体,成功分离到拟南芥和油菜中的LPCAT基因,并进一步分析了油菜LPCAT基因的表达谱以及油菜LPCAT的酶活性。主要研究结果如下：1.酵母LPCAT缺失突变体lcalΔ对LPC的结构类似物——溶血血小板活化因子(lyso-platelet-activating factor, lyso-PAF)表现敏感。根据这一特性,我们用拟南芥幼苗cDNA文库转化酵母lcalΔ突变体,通过功能互补,分离到已报道的2个溶血磷脂酰基转移酶(lysophospholipid acyltransferase, LPLAT)基因AtLPLATl (Atlg12640)和AtLPLAT2(At1g63050)。尽管拟南芥中还存在其他已确定的LPLAT基因,我们的结果表明AtLPLATl和AtLPLAT2是拟南芥中仅有的2个能互补lcalΔ突变体的基因,也说明了该互补筛选的方法是严谨和有效的。2.为了进一步分离油菜中的LPCAT基因,构建了油菜栽培品种Hero种子不同发育时期的cDNA文库,并用来互补酵母IcalΔ突变体。通过互补实验分离到3个油菜LPCAT基因,分别被命名为BnLPCATl-1, BnLPCAT1-2和BnLPCAT2。阳性克隆测序发现,BnLPCAT1-2在cDNA文库中存在多个具有单碱基差异的cDNA,而BnLPCAT1-1和BnLPCAT2的cDNA中不存在任何单碱基差异。序列比对显示,BnLPCAT1-1和BnLPCAT1-2是AtLPLAT1的直系同源基因,而BnLPCAT2是AtLPLAT2的直系同源基因。3.氨基酸序列分析显示,BnLPCAT蛋白属于膜结合O-酰基转移酶(membrane-bound O-acyltransferase, MBOAT)家族,含有溶血磷脂酰基转移酶活性所必需的3个保守MBOAT模体(motifs A-C)。在motif B中,存在一个高度保守的组氨酸残基,被认为是MBOAT家族中一个可能的活性位点残基。进化树分析表明,BnLPCAT的同源蛋白广泛分布在双子叶植物、单子叶植物、裸子植物、苔藓植物和藻类等不同的植物类别中。4.分析了BnLPCAT1-1和BnLPCAT2蛋白在不同溶血磷脂和脂酰辅酶A存在时的体外酶活性。用不同溶血磷脂作酰基受体时,BnLPCAT1-1和BnLPCAT2均对LPC有很强的活性,表明它们具有溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶活性。而且两者对16:0-LPC、18:0-LPC和18：1-LPC具有同等活性,说明它们对溶血磷脂sn-1位点的酰基没有明显偏爱性。用不同脂酰辅酶A作酰基供体时,BnLPCAT1-1和BnLPCAT2都偏爱不饱和脂酰辅酶A。两者均对22：1-CoA表现较低活性,说明了超长链不饱和脂酰辅酶A不是两个酶能有效利用的底物。在所有的酶活性分析实验中,BnLPCAT2的活性都明显高于BnLPCAT1-1。5.利用定量Real-time RT-PCR分析了BnLPCAT1-1和BnLPCAT2在不同组织中的表达水平。BnLPCAT1-1和BnLPCAT2在所有组织中都表达,而且BnLPCAT1-1的表达水平要明显高于BnLPCAT2。BnLPCAT1-1在生长1周的幼苗中表达量最高,其次是叶片、花蕾和花,而BnLPCAT2的表达量在花蕾中最高。