目的本课题采用传统分离纯培养法、PCR-DGGE技术和基于宏基因组的高通量测序技术,通过检测细菌16S rRNA基因片段确定细菌种类,分析了家蝇各虫态体内共生菌群结构的多样性,探讨共生细菌在家蝇各虫态中的变化规律,并分析三种实验方法在昆虫共生细菌分离鉴定中的优劣。研究方法1.传统分离培养75%酒精消毒体表,无菌水漂洗,去除体表菌。幼虫通过饥饿去除肠道暂住菌。将去除体表菌的家蝇各连续发育阶段的卵、幼虫、蛹以及进食和未进食的成蝇在无菌条件下充分研磨,取研磨液划线接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上,37℃培养并纯化。挑取分离纯化的单菌落于LB液体培养基中,37℃110 r/min过夜培养。CTAB法提取菌液DNA。使用引物27F/1527R进行PCR扩增,扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行检测。有目的条带的PCR产物送公司测序。2.非培养方法75%酒精消毒体表,无菌水漂洗,去除体表菌。幼虫通过饥饿去除肠道暂住菌。将去除体表菌的家蝇未成熟虫态各阶段在无菌条件下充分研磨,加入500μl TE缓冲液重悬研磨物,采用氯仿法提取总DNA。2.1变性凝胶梯度电泳提取的家蝇不同发育阶段的总DNA通过引物27F/1527R进行第一次PCR扩增。将扩增的PCR产物作为模板,使用968GC/L1401引物进行二次PCR扩增。所得PCR产物进行变性凝胶梯度电泳。电泳结束后,凝胶在EB溶液中染色30 min,取出凝胶,在凝胶成像仪下切取明亮条带于离心管中。目的凝胶经无菌水冲洗2遍后捣碎,溶于30μl无菌水中,4℃过夜。将含有目的DNA凝胶的液体作为模板,使用不含GC夹的968/L1401引物进行扩增。PCR扩增产物送公司测序。2.2高通量测序将提取的家蝇未成熟虫态各阶段体内总DNA送测序公司,采用Illumina MiSeq平台进行测序。结果经传统方法分离培养法共分离纯化家蝇各阶段肠道菌28种菌属,其中卵期未分离到共生细菌,幼虫期分离到肠道共生细菌11种,蛹期19种,未进食成蝇10种,进食成蝇13种;PCR-DGGE技术分离出幼虫期和蛹期体内的共生细菌共7种菌属,主要以葡萄球菌属和普罗威登斯菌属为主;宏基因组测序结果表明,家蝇未成熟虫态各阶段体内菌群主要优势细菌属于变形菌门和拟杆菌门,以香味菌属和鞘氨醇杆菌属为优势菌属,且一直存在于家蝇发育变态过程中。由于家蝇卵中未分离到共生细菌,而在家蝇幼虫孳生的培养介质中分离到细菌13种,主要以变形杆菌属和香味菌属为主,与家蝇幼虫肠道中分离到的共生细菌有9种相同,推测家蝇幼虫肠道内的共生细菌主要来源于食物和环境。结论通过传统分离培养法、PCR-DGGE技术和宏基因组高通量测序三种方法对家蝇发育过程中体内细菌类群进行鉴定分析发现,家蝇不同发育阶段体内菌群复杂多样,推测菌群的种类和数量变化与其发育变态过程有一定联系。三种分离方法各有优势,传统分离培养方法能够获得菌株,可进行直观的形态学观察及生理生化特性鉴定等,对全面了解细菌特性和功能验证奠定基础,但只能得到可培养的细菌,对于不可培养的细菌则难以得到任何信息,且受人为因素影响大;PCR-DGGE技术对于细菌种类较少、类别差异较大的菌群进行分离时有较大的优势,但对于种类复杂,细菌类群过于相似的菌群进行分离时,则难以得到理想结果,可重复性不高,易受人为操作水平的影响;基于宏基因组的高通量测序方法,是一种新型的细菌菌群鉴定方法,可得到全部的细菌类群信息,方法简单、快速,可重复性强,是一种先进的、可标准化的细菌混合类群鉴定方法,容易获得可培养细菌和不可培养细菌的全部信息,但同PCR-DGGE技术一样,无法获得纯菌株,不能用于细菌的功能验证。