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恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)是蘑菇覆土层中优势菌群,可显著提高双孢蘑菇菌丝的生长速度及诱导并促进子实体的形成和发育,但其机理尚未见报道。本研究主要利用从恶臭假单胞菌克隆ACC脱氨酶基因,并构建转恶臭假单胞菌acdS脱氨酶基因的双孢蘑菇工程菌,探讨ACC脱氨酶对双孢蘑菇出菇的影响,结果如下:(1)通过已报道的恶臭假单胞菌的1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶(acdS)的DNA序列设计引物并克隆该基因。利用酶切,酶连等方法将目的基因连接到双孢蘑菇内源启动子下游,然后连接到载体PBHG上,构建ACC脱氨酶双元表达载体PBHG-acdS,为进一步的农杆菌介导转化双孢蘑菇AS2796准备了实验材料。(2)构建好的双元表达载体,转入到农杆菌EHA105中,利用根癌农杆菌Ti质粒介导法具有的转基因比较稳定,拷贝数低,转化效率高等优点,将ACC脱氨酶基因导入双孢蘑菇菌褶中,成功的筛选到转恶臭假单胞菌ACC脱氨酶基因的双孢蘑菇工程菌。(3)在DNA水平上和RNA水平上对筛选到的双孢蘑菇转化子进行验证,结果都能够在双孢蘑菇菌丝中检测到ACC脱氨酶基因,同时检测到转化子具有ACC脱氨酶活性,也能够促进菌丝的生长且达到极显著水平。在覆上灭菌的蛭石作为覆土材料后,转化子在原基形成的时间上比空白对照早,这也说明了转入的ACC脱氨酶能够促进双孢蘑菇子实体的形成和发育。以上结果表明构建的外源基因ACC脱氨酶双元表达载体通过农杆菌介导的方法能够稳定的整合到蘑菇的基因组中,也能够在其内源启动子的启动下进行转录和翻译,高浓度的潮霉素又进一步验证了插入的外源基因并没有在双孢蘑菇的无性繁殖传代中丢失,这也说明通过农杆菌介导外源基因转化,能稳定的存在双核的担子菌基因组中。ACC脱氨酶酶活性测定结果也表明,外源ACC脱氨酶基因在双孢蘑菇AS2796中表达。出菇实验结果说明ACC脱氨酶能够降解双孢蘑菇菌丝产生的ACC,从而减少菌丝产生乙烯的量,进而解除了乙烯对双孢蘑菇子实体原基形成和发育的抑制作用,促进双孢蘑菇生长。