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由于雄激素受体（Androgen receptor,AR）通路能够促进细胞DNA损伤修复的能力,因此在对局部进展期前列腺癌（Prostate cancer,PCa）患者的治疗中,雄激素剥夺疗法（Androgen Deprivation Therapy,ADT）可以显著增强放射性治疗的效果,这种协同疗法在临床治疗中被广泛应用。然而,一部分患者起初却对这种协同治疗方式并不敏感且很多治疗效果良好的患者也会在一段时间后复发,严重影响了这种治疗方法的最终效果。值得注意的是,ADT对雄激素受体（Androgen Receptor,AR）通路的抑制作用无法长期有效,在ADT的作用下,患者体内的雄激素水平虽然受到了抑制,但该疗法会促进AR的可变剪接产生雄激素受体可变剪接体（Androgen Receptor Splicing Variants,ARVs）。与AR不同的是,目前已发现的大部分ARVs缺少配体结合结构域,使得ARVs在雄激素存在与否的情况下,都能够定位于细胞核,引起AR信号途径的雄激素非依赖性激活。最近有研究表明,在AR通路被抑制时,ARVs将代偿性促进非同源末端连接（Non-homologous end joining,NHEJ）通路的活性,从而导致患者对这种基于DNA损伤的协同疗法产生抵抗。显然,这个可能的机制为解释部分患者的治疗耐受提供了合理的依据。但是,人们目前对特定ARVs的功能及ARVs调控DNA损伤应答（DNA damage response,DDR）通路的具体机制仍缺乏深入研究。另外,最近部分文章提出了ARVs可能独立于AR参与调控DDR通路的活性,特别是促进某些参与细胞DNA损伤修复进程相关基因的表达,这种独特的调控作用引发了人们对于其具体功能的进一步思考。研究表明,当聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[Poly（ADP-ribose）polymerase,PARP]受到抑制时,将引起同源重组（Homologous recombination,HR）途径缺陷的癌细胞死亡,这一发现为PARP抑制剂在癌症治疗中的应用提供了理论基础。理想的Ⅲ期临床试验结果使PARP1抑制剂奥拉帕利（Olaparib,Ola）得以在2020年批准使用,用于专门治疗携带有突变HR基因的转移性去势抵抗性前列腺癌（Metastatic castration-resistant prostate cancer,m CRPC）患者,由于之前的研究表明AR信号可以刺激HR通路,这提示我们AR拮抗剂和PARP抑制剂之间可能具有协同作用。但是PARP抑制剂在PCa中的研究和使用是有限的,调节患者对于PARP抑制剂敏感性的分子机制尚未可知,需要更深一步的探究。鉴于ARVs中表达最多,临床意义最重要的是雄激素受体可变剪接变异体7（Androgen Receptor Splicing Variant 7,ARv7）,并根据以往对AR信号和DDR通路的研究结果,我们推测ARv7可能介导了HR通路的恢复,导致即使在激素治疗的共同作用下,患者依旧对PARP抑制剂不敏感。因此,破译ARv7在DDR通路的具体作用和其调控该通路的具体分子机制对于筛选AR抑制剂和PARP抑制剂联合疗法的适应人群也可能至关重要。本研究基于慢病毒系统改变多种PCa细胞中ARv7的表达水平,通过研究电离辐射及阿霉素（Doxorubicin hydrochloride,Dox）作用下PCa细胞DDR的改变以及AR抑制剂和PARP抑制剂联合处理下PCa细胞生存率的改变,分别探讨ARv7对于PCa细胞遭遇DNA损伤后修复能力的变化以及AR拮抗剂和PARP抑制剂协同作用的影响,为克服前列腺癌放疗耐受提供新的机制探索并为基于PARP抑制剂的新型PCa治疗应用提供重要参考指标。实验方法:1、利用慢病毒载体构建恒定改变ARv7表达的前列腺癌细胞系C4-2,PC-3（ARv7过表达）,22RV-1（沉默内源性ARv7）。2、细胞模型建立后,通过免疫荧光技术,碱性彗星实验（单细胞电泳）,免疫印迹（Western Blot,WB）,克隆形成等指标的分析,探究在电离辐射和Dox的作用下,ARv7是否参与调控DDR通路及细胞对DNA损伤的敏感性。3、通过检测ARv7改变后AR的表达,核定位等变化,探究ARv7在AR被显著抑制后是否还具有调节DDR的能力从而探讨ARv7是否能够独立于母体AR促进DDR。4、借助于生物信息学分析,对恒定改变ARv7表达的前列腺癌细胞系C4-2（ARv7过表达）,22RV-1（沉默内源性ARv7）进行转录组测序。通过KEGG和GSEA探究改变ARv7的表达会引起细胞中哪些通路发生变化,并运用实时荧光定量核酸扩增检测系统（Real-time Quantitative PCR Detecting System,q PCR）技术确定ARv7参与调控这些通路的某些基因。5、利用免疫共沉淀（Co-inmunoprecipitation,IP）等实验进一步验证ARv7是否与PARP1及NHEJ修复中核心蛋白DNA依赖性蛋白激酶,催化亚基（DNA-dependent protein kinase,catalytic subunit,DNA-PKcs）之间存在相互作用,使用WB验证ARv7对PARP1和DNA-PKcs活性的影响,并运用q PCR验证在PARP1抑制剂奥拉帕利（Olaparib,Ola）存在的情况下,ARv7的转录功能是否受到影响。6、将PARP1抑制剂Ola和AR抑制剂恩杂鲁胺（Enzalutamide,Enz）联用,通过MTT比色法实验计算Ola和Enz的联合指数,并使用WB,流式细胞术,克隆形成等指标实验探究ARv7的高表达是否对这种联合用药效果产生影响。结果:1、过表达ARv7促进了细胞对电离辐射及Dox诱导的DNA双链断裂（DNA double-strand breaks,DSBs）的修复速度,而沉默内源性ARv7降低了细胞对DSBs的修复速度。2、沉默或过表达ARv7后,无论总蛋白中的AR,还是胞质与胞核中AR表达水平均没有明显变化。在没有AR体系的前列腺癌细胞PC-3过表达ARv7后,修复DSBs的速度明显加快。使用Enz抑制AR活性后,过表达ARv7的C4-2细胞修复DSBs的速度相较于载体对照组显著加快。3、KEGG与GSEA分析显示改变ARv7的表达后,HR通路会随之改变,两者具有很强的相关性。沉默或过表达ARv7后,参与HR通路的一些关键基因的表达量发生相应地降低或升高。HR活性检测实验结果表明:过表达ARv7组通过HR修复DNA损伤的细胞数目显著高于对照组。4、同样的,过表达ARv7组通过NHEJ修复DNA损伤的细胞数目高于对照组,ARv7能够与DNA-PKcs结合,促进DNA-PKcs的磷酸化。转录组测序和PCR结果显示过表达/沉默ARv7后,在NHEJ修复通路起始过程中的关键基因RNA聚合酶Ⅱ延伸因子（ELL2 polymerase elongation factor 2,ELL2）的表达量分别有明显增加/减少。此外,ARv7还与PARP1有相互作用,在Ola抑制PARP1活性后,由ARv7过表达引起转录水平上调的基因回归到正常水平,主要介导DNA损伤应答通路的共济失调毛细血管扩张突变基因（Ataxia telangiectasia-mutated gene,ATM）的磷酸化水平下降。5、联合指数显示PARP1抑制剂Ola和AR拮抗剂Enz联合杀伤前列腺癌细胞能力增强,并且高表达ARv7的细胞能够削弱Ola与Enz联合的杀伤作用。结论:1、ARv7表达水平与PCa细胞DNA双键断裂后的修复速度密切相关,并且ARv7可以独立于全长AR发挥作用。2、ARv7通过调控HR和NHEJ通路促进了前列腺癌细胞对DSBs的修复。3、ARv7-PARP1形成正调控环介导促进DDR。4、ARv7可以削弱AR抑制剂和PARP抑制剂的协同作用。