熊去氧胆酸(英文名:Ursodesoxycholic acid,UDCA),是传统的中药的有效成分,有着非常广泛的临床应用和卓越的药用价值,在治疗胆结石,促进肝移植,胆汁反流性胃炎,酒精肝,胆汁性肝硬化,和药物诱发的肝炎,有非常好的疗效,市场用量很大。目前,制备UDCA主要有活熊取胆汁和人工合成两种方法,天然来源是活熊取胆或熊胆汁,活熊受到动物保护法的保护,提取来源受到限制造成天然熊胆的来源日趋减少。人工合成是指使用能够大量获取的牛、鹅胆汁提取的鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholic acid,CDCA)化学法合成UDCA,通过氧化还原的方法使7-OH发生构型反转,但是存在着反应过程复杂、低选择性、反应条件苛刻、能耗大、污染大等一系列问题,尤其是保护和脱保护过程中需要有毒和危险试剂,严重限制了化学法的工业化应用。目前使用化学法生产的UDCA约占到市场份额的30%,而且制备高纯度较低,约80%左右,还远不能满足市场对UDCA的用量及质量的需求。与化学差向异构化相比,CDCA生物合成UDCA具有高效性和相对环境友好性。微生物转化或生物酶催化主要围绕7α-羟基类固醇脱氢酶(7α-HSDH)和7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH)展开,利用产7α-HSDH和7β-HSDH的泥渣梭菌、不和谐梭菌、巴氏梭菌和嗜麦芽黄单胞菌,实现了CDCA向UDCA的生物转化。然而,高浓度的CDCA抑制细胞生物量的积累,在产品回收和纯化过程中存在困难。此外,以往的研究表明,随着培养时间的延长,中间体的产量增加,UDCA降低,无法实现工业化生产。近年来,联合应用7α-HSDH和7β-HSDH将CDCA为底物两步法生成UDCA,成为研究热点,目前已经有研究的综合转化率能超过90%,但反应量仅为毫升级别,距离工业化生产还有很大距离。主要的限制性瓶颈为:1)以CDCA为底物两步法中的关键酶7β-HSDH极度不稳定,尽管酶活够高,但在催化反应体系中会快速失活;2)两步法的反应体系能够承载的底物量太低(体积比1%),体系不稳定;3)两步法的两种关键酶工业级应用的大规模来源问题;4)酶蛋白分离纯化的成本过高。本论文针对7β-HSDH极度不稳定,底物浓度太低和无法实现工业化生产的主要限制性瓶颈,在成功构建和异源表达7α-HSDH和7β-HSDH的基础上,主要从基因工程酶的构建过程和酶催化体系的构建来提高7β-HSDH酶催化性能方面着手,提高体系中酶的稳定性,提高底物承载能力,使其适应酶催化的工业化生产过程;通过发酵培养工艺优化,探索大规模发酵工艺,酶催化过程工业酶的来源问题;最后,公斤级工业化生产和纯化工艺的研究。基因工程酶7β-HSDH的构建过程中标签对实际催化过程有着很大的影响,尽管带有6His标签的重组酶7β-HSDH有更高的酶活,但是带有GST标签的重组酶7β-HSDH有更高的热稳定性,更适合实际工业催化过程。经过测酶活和实际催化对比发现,用热稳定性模拟、考察6His和GST两种不同标签的7β-HSDH重组酶在40°C下的失活曲线特性,验证了GST标签的7β-HSDH重组酶较6His标签的重组酶的热稳定性增加12倍。同时,酶催化体系的构建过程中,在体系中添加该复合稳定剂(0.15%EDTA+0.5%氯化钠+0.2%明胶),可以很大程度地提高体系中酶的稳定性,酶活残留率为97.8%,提高底物承载能力,使重组酶可以持续进行催化反应。对两种重组菌培养及诱导条件进行了优化摸索,并实现50L发酵罐的高密度发酵,重组菌的OD值达到100,7α-HSDH和7β-HSDH酶生物活性分别为13.6 U/mL和7.6 U/mL,解决了两种关键酶的大规模来源问题。最后,构建了一套高效的UDCA酶催化生产工艺,表达两种关键酶的重组菌进行高密度发酵后,发酵液经过破碎和初步过滤,得到的粗酶液即可投入催化反应体系进行催化,降低了酶蛋白纯化成本,提高了底物承载量,实现了在最高50L的催化反应体系中进行反应,底物承载量达到50g/L,催化反应的得率和效率达到工业化应用的要求,最终成功应用于由CDCA到UDCA的公斤级工业化生产,成品收率大于90%。