仿刺参(Apostichopus japonicus)转录组分析与遗传图谱构建

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1仿刺参的基因组大小测定本实验以栉孔扇贝Chlamys farreri为内标,用流式细胞仪测定了仿刺参Apostichopus japonicus (Selenka,1867)的不同组织(体壁、肌肉、肠道、呼吸树)的基因组大小(C值),结果发现用不同组织测出的仿刺参基因组大小均比较接近,最终得出仿刺参的基因组大小为0.878±0.02pg,即859Mb(以1pg DNA=978Mb计算)。仿刺参基因组大小的测定将有助于该物种基因组方面的研究。2仿刺参的转录组测序和分析为系统了解仿刺参转录组的特征,我们选取了不同发育时期的仿刺参,以及成体仿刺参的不同组织为材料,共构建了8个cDNA测序文库,进行了454GS FLX测序及生物信息学分析。测序共得到1,061,078条平均长度为344bp的序列。经过小片段去除和质量筛查后,共获得92%的高质量序列。这些高质量的序列经过拼接得到33,835条Contigs,以及199,011条Singletons。Contigs进一步拼接成29,666条Isotigs,这些Isotigs聚类成21,071个Isogroups。通过与公共蛋白数据库(Swiss-Prot和nr)及核酸数据库(nt)比对,47%的Isogroups获得了注释信息。对于被注释的基因序列,我们进一步根据基因功能作了分类。Gene Ontology(GO)注释和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)代谢通路分析结果表明,这些基因参与了多种生物学过程。此外,通过比较分别以夏眠前和夏眠中仿刺参的多个组织构建的两个cDNA文库,还获得了一些与夏眠相关的候选基因。随机选取了12个表达有明显差异的基因进行Q-PCR验证,结果发现在测序中有明显表达差异的基因经Q-PCR验证也有明显差异,说明测序结果比较真实地反应了文库中基因的表达信息。通过比较仿刺参与紫海胆Strongylocentrotus purpuratus的转录组发现,两个物种的GO分布非常相似,同时获得4,882个同源性较高的基因,其中,有202个基因在非棘皮动物未被发现。此外,通过生物信息学预测,共获得了730个SSR和54,185个SNP。仿刺参转录组的获得,将有助于仿刺参遗传学和基因组学研究工作的开展。3仿刺参的遗传图谱构建应用2b-RAD技术,以仿刺参90个F1子代为作图群体,以拟测交理论为作图策略,构建了仿刺参的遗传连锁图谱。研究中,共得到2,010个可以被分型的SNPs,其中符合孟德尔分离比(P≥0.05)的标记有1,484个。构建的图谱包含917个标记,分布于22个连锁群上。每个连锁群标记数目为16-98不等,平均标记数为42,连锁群长度在13.5cM-113.8cM之间,相邻标记的平均间隔为1.64cM。图谱的总长度为1,467cM,覆盖率为94.89%。该图谱为首张基于SNP标记的仿刺参遗传连锁图谱,将为今后仿刺参的遗传学研究如功能基因定位、分子标记辅助育种等提供方便。
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