喉癌是耳鼻咽喉科原发于上皮的恶性肿瘤,占耳鼻咽喉科恶性肿瘤的11%-22%。尽管近几十年来喉癌的治疗方法取得了较大的进展,但在生存率和患者生活质量方面仍然需要提高。随着新的化疗药物的不断出现,喉癌的治疗也过渡到了手术,放疗和化疗的综合性治疗,因此研究和探索喉癌更多的更有效的化疗药物有着深远的意义。过氧化酶增殖体激活受体(peroxisome poliferator-activited receptor, PPAR)是一种细胞核转录因子,具有多种生物学效应并参与多种机体生理反应,尤其是在脂肪的贮存和代谢中发挥重要的无可比拟的作用。目前的研究表明PPAR分为三种亚型(α,δ,γ),其中PPARy亚型与肿瘤关系最为密切,因此在肿瘤的功能研究的也得最为广泛和深入。很多报道都显示PPARy在多种肿瘤组织中表达,当应用PPARy激动剂作用后就可以引起肿瘤细胞增殖和侵袭能力的抑制、血管形成减少及诱导凋亡等肿瘤细胞的恶性生物学行为改变。因此,近年来以PPARy为靶点的药物研究进展迅速,已成为当前抗肿瘤药物研究开发的热点之一PPARy激动剂可分为天然激动剂和合成激动剂两大类。人工合成PPARy激动剂则以噻唑烷二酮类(thiazolidinedione compounds, TZDs)最为代表,在临床上应用于糖尿病的治疗。近几年的大量研究表明TZDs可以有效地抑制多种肿瘤细胞的增殖,抑制肿瘤新生血管的形成,阻滞细胞周期的进行,诱导凋亡,况且TZDs作为糖尿病主要治疗药物因其疗效好,副作用少在临床上广泛应用多年,所以TZDs对肿瘤的增殖抑制作用显得更为有意义。研究表明TZDs的抑瘤机制十分复杂,甚至有学者提出TZDs有可通过激活PPARγ外的其它途径来发挥抗肿瘤的作用,但是TZDs的抗肿瘤作用却是毋庸质疑的。为了深入探讨TZDs对喉癌Hep-2细胞的影响,本研究首先应用TZDs代表药物罗格列酮(Rosiglitazone, RGZ)和曲格列酮(Troglitazone, TRG)在体外作用于Hep-2细胞,采用MTT、流式细胞术、Real-time PCR、western和ELISA多种分子生物学技术体外观察了TZDs对Hep-2细胞增殖、凋亡和缺氧诱导的HIF-1α和VEGF的影响并探讨其发生机制；接着在体外实验的基础上,我们研究观察RGZ和TRG对人喉癌Hep-2细胞裸鼠皮下移植瘤影响及机制及RGZ和TRG在荷瘤裸鼠的毒性反应,为喉癌化学治疗拓展新的思路和方法,为将来以PPARγ为靶点的喉癌防治提供理论基础及实验依据,为TZDs的开发、临床应用提供有价值的实验依据。本研究分为以下三章：第一章RGZ和TRG对人喉癌Hep-2细胞增殖、凋亡的影响及机制研究方法1.采用MTT比色法测定经12.5、25、50、100μmol/L RGZ或TRG分别作用12、24、36、48、60、72h后的Hep-2细胞增殖活性的改变。2.采用流式细胞术分别检测经50μmol/L RGZ或TRG作用0、24、48、72h后的Hep-2细胞凋亡率和细胞周期分布。3.采用Real-time PCR和western方法分别检测经50μmol/L RGZ或TRG作用0、24、48、72h后Hep-2细胞中COX-2和p65 mRNA和蛋白及VEGFmRNA水平的变化。4.采用ELISA方法分别检测经25、50、100μmol/L RGZ或TRG作用24h后Hep-2细胞培养上清液中VEGF蛋白水平的变化。结果1.RGZ或TRG作用后导致细胞的增殖活性明显受到抑制,其抑制率呈浓度依赖性和时间依赖性增加(P<0.05)。2.流式细胞术结果显示50μmol/L RGZ或TRG作用24、48、72h后,G0/G1期细胞比例呈时间依赖性逐渐升高(P<0.01),S期细胞比例逐渐降低(P<0.01),而G2/M期细胞比例也呈逐渐降低趋势(P<0.01)；随着RGZ或TRG作用时间延长,细胞凋亡率呈时间依赖性逐渐增加,不同时间组间存在显著性差异(P<0.01)。3. Real-time PCR和western结果显示经50μmol/L RGZ或TRG作用24、48、72h后Hep-2细胞中COX-2和p65 mRNA和蛋白及VEGF mRNA表达水平呈时间依赖性的下降,不同时间组间有显著性差异(P<0.01)。4. ELISA结果显示经25、50、100μmol/L RGZ或TRG作用24h后Hep-2细胞培养上清液中VEGF蛋白水平呈时间依赖性的下降,不同时间组间有显著性差异(P<0.01)。第二章RGZ和TRG对缺氧诱导的Hep-2细胞HIF-1α和VEGF表达的影响研究方法1采用MTT法检测缺氧环境下经12.5、25、50、100μmol/LRGZ或TRG分别作用12、24、36、48、60、72h后Hep-2细胞增殖活性的改变。2.缺氧环境下经25、50、100μmol/L RGZ或TRG作用Hep-2细胞24h后,采用Real-time PCR和ELISA法分别检测细胞中VEGF mRNA和培养上清液蛋白水平的变化。3.采用Real-time PCR和western检测RGZ或TRG作用Hep-2细胞16h后Hep-2细胞中HIF-1αmRNA和蛋白水平的变化。4.采用western方法检测缺氧环境下经25、50、100μmol/L RGZ或TRG作用6h后Hep-2细胞中p-AKT/AKT, p-ERK1/2/ERK1/2, p-STAT3/STAT3蛋白水平的变化。5.采用transwell小室侵袭实验检测50μmol/LRGZ或TRG在缺氧和常氧环境下对Hep-2细胞侵袭能力的影响。6.采用明胶酶谱法分析50μmol/LRGZ或TRG在缺氧和常氧环境下对Hep-2细胞MMP-2活性的影响。结果1.MTT结果表明缺氧环境下RGZ和TRG作用Hep-2细胞后细胞的增殖活性受到明显抑制,且比常氧环境下对细胞的抑制作用更为明显,细胞抑制率具有时间依赖性和剂量依赖性(P<0.01)。2. Real-time PCR和ELISA结果显示RGZ和TRG呈浓度依赖性抑制缺氧诱导的培养上清液中VEGF蛋白和细胞内mRNA的水平,各组间差异有统计学意义(P<0.01)。而HIF-1αmRNA表达水平在各浓度组均无明显改变(P>0.05)。3. western结果表明RGZ和TRG呈浓度依赖性抑制缺氧诱导的Hep-2细胞HIF-1α、p-AKT、p-ERK1/2和p-STAT3蛋白的表达,各组间差异有统计学意义(P<0.01)；而AKT、ERK1/2和STAT3蛋白表达水平在各浓度组均无明显改变,各组间差异无统计学意义(P>0.05)。4. Transwell小室侵袭实验结果表明缺氧和常氧环境下RGZ和TRG都可以明显的抑制Hep-2细胞的侵袭,各组间差异有统计学意义(P<0.01)。5.明胶酶谱法分析结果表明缺氧和常氧环境下RGZ和TRG均可以抑制Hep-2细胞MMP-2活性,各组间差异有统计学意义(P<0.01)。第三章RGZ和TRG对人喉癌Hep-2细胞裸鼠移植瘤的影响研究方法1.建立人喉癌裸鼠移植瘤模型后随机分为对照组、RGZ实验组和TRG实验组,每组6只,治疗组瘤内注射50μmoL/L的RGZ和TRG,每3天注射一次；瘤内注射0.5%二甲基亚砜。共治疗4周。2.每d观察裸鼠的饮食、活动等生理状况。每周测量瘤体大小及裸鼠体质量,绘制肿瘤生长变化曲线。待4周后治疗结束时处死小鼠,剥瘤称重,计算质量抑瘤率。HE染色后光学显微镜下观察脑、心、肝、肺、脾和肾等重要脏器变化。3.采用免疫组化技术检测各组裸鼠移植瘤CD34抗原表达情况,并对染色结果进行统计分析计算MVD值。4.采用Real-time PCR和western技术检测各组移植瘤COX-2、p65、HIF-1α和VEGF mRNA及蛋白表达情况。结果1.与对照组相比,RGZ和TRG能明显抑制裸鼠移植瘤的生长,对照组和实验组裸鼠瘤体积、瘤质量组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。2.治疗过程中,裸鼠未见明显不良反应。治疗结束时各组心、肝、肺、脾、肾等重要脏器无明显器质性改变。3.与对照组相比,实验组肿瘤组织中MVD值明显减少,三组间MVD值相比差异具有统计学意义(P<0.01)。4. Real-time PCR和western结果表明RGZ和TRG能抑制裸鼠移植瘤COX-2、p65和VEGF mRNA和蛋白及HIF-1α蛋白的表达,组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。结论1.RGZ和TRG对Hep-2细胞具有浓度和时间依赖性增殖抑制作用,阻滞Hep-2细胞于G0/G1期,诱导细胞凋亡,其机制与抑制COX-2和p65蛋白和mRNA及VEGF mRNA的表达,下调VEGF蛋白的分泌有关。2.缺氧环境下RGZ或TRG依然对Hep-2细胞增殖有明显的抑制作用,能抑制VEGFmRNA的表达和培养上清液VEGF蛋白的分泌,下调缺氧诱导的HIF-1α蛋白水平；其机制与抑制AKT、ERK1/2和STAT3蛋白磷酸化及通过蛋白酶体通路促进HIF-1α蛋白的降解密切相关；能抑制常氧和缺氧环境下Hep-2细胞的侵袭,其机制与降低MMP-2活性密切相关。3.RGZ和TRG能抑制喉癌裸鼠移植瘤生长,降低肿瘤组织MVD值,下调喉癌裸鼠移植瘤COX-2、p65、HIF-1α和VEGF表达。且对机体无明显毒、副作用。