紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是一种多年生优质豆科牧草,它不仅营养价值高、适口性好,而且适应性强,是全世界广为种植的优良牧草,有“牧草之王”之美誉。然而,由于紫花苜蓿对酸性土壤铝毒的极度敏感性,从而限制了其在该地区的推广种植。如何进一步提高紫花苜蓿的耐铝性,扩大其种植范围,是当前紫花苜蓿生产面临的重要研究课题。转基因技术的发展和应用为耐铝性紫花苜蓿的培育开辟了一条新的途径。基于此,本课题对紫花苜蓿离体培养植株的再生及遗传转化的条件进行了研究。在此基础上,通过农杆菌介导法将柠檬酸合酶基因导入紫花苜蓿中,开展了改良紫花苜蓿耐铝性状的转基因研究。主要研究结果如下：1.紫花苜蓿体胚发生的诱导及其植株再生以紫花苜蓿4日龄无菌苗的子叶和下胚轴为试材,研究了四种不同的基础培养基(MS、SH、SHO、MSHO)对紫花苜蓿愈伤增殖的影响。结果表明,改良的SH培养基(MSHO)是紫花苜蓿愈伤增殖的最适基础培养基,且在不同培养基条件下,子叶外植体的愈伤增殖速度都明显高于下胚轴(P<0.05)；在培养基中配合添加2 mg／l 2,4-D与0.05mg/l Kt是紫花苜蓿胚状体诱导的最佳激素组合,该激素组合条件下其胚性愈伤的诱导率和平均胚状体数分别达78.3%和5.7；从愈伤组织上挑取生长处于球形或心形期的胚状体,将其放于无激素的改良SH培养基中进行培养,10天后会有大量次生胚状体(1-30个／胚状体)产生；将生长处于鱼雷或子叶期的胚状体移植到无激素的1／2MS培养基中,其中96.9%的胚状体可成功建植为无菌小苗；应用该体系进行紫花苜蓿离体培养再生,不同品种间存在着显著的基因型差异,其胚状体诱导率介于0-76.6%之间。2.紫花苜蓿直接不定芽的诱导及其植株再生为诱导紫花苜蓿直接不定芽的发生,本研究以紫花苜蓿成熟胚的子叶节为外植体,将其放在含有不同TDZ浓度的改良MS(MS无机+B5有机)固体培养基中进行培养。研究发现,当将新诱导出来的腋芽切除后,子叶节外植体近顶芽区会有大量的不定芽被诱导出来。然而,随着不定芽的进一步生长,大多数的不定芽出现了严重的玻璃化现象。鉴于此,本研究对培养的条件作了进一步的优化,结果表明,降低TDZ浓度(从0.05 mg／l降到0.025 mg／1)以及改变外植体的培养方式(将外植体由水平放置培养改为垂直插入式培养),两者都能够显著降低不定芽玻璃化的发生率(P<0.05)。添加AgN03(乙烯抑制剂)虽不能有效降低玻璃化率,但能显著提高外植体的平均不定芽诱导数；根诱导试验表明,切取不定苗,并将其浸泡在1.0 mg／l NAA溶液中2分钟,然后再转入无激素的1／2MS培养基中培养,可使其根的诱导率高达83.3%,显著高于其他试验组(P<0.05)；利用该体系对8个不同紫花苜蓿品种进行再生试验,结果表明,所有参试品种均成功再生,其平均不定芽诱导率介于63.8-82.5%之间。3.紫花苜蓿遗传转化体系的研究为提高紫花苜蓿遗传转化的效率,本研究对影响紫花苜蓿转化效率的几项主要因素进行了研究。结果表明,当以HPT为筛选标记基因时,农杆菌LBA4404对紫花苜蓿的侵染能力强于EHA105,而且添加10mg／l的乙酰丁香酮能有效提高其转化效率；受体系统不同对苜蓿转化效率的影响也很大,当以直接不定芽分化再生途径为转化受体系统时,其转化率最高仅为2.25%,而胚状体再生途径则可达10.6%；当培养基中添加的蔗糖与甘露糖浓度分别为10和20 g／l时,即可有效抑制子叶愈伤组织体胚的发生。但对下胚轴而言,只有将甘露糖作为培养基的唯一碳源,才能显著抑制其体胚的发生(P<0.05)；当以PMI为筛选标记基因进行紫花苜蓿遗传转化时,其转化效率显著高于以HPT为筛选标记基因的转化效率,且不同类型外植体的转化效率差异较大,其中,子叶外植体的转化效率(39.6%)显著高于下胚轴的转化效率(29.2%)(P<0.05)。4.紫花苜蓿转柠檬酸合酶基因对其细胞耐铝性的影响为研究紫花苜蓿转不同来源(原核和真核生物)柠檬酸合酶基因(CS)对其细胞耐铝性的影响,本研究应用分子克隆手段,分别从大肠杆菌和粳稻中克隆了柠檬酸合酶基因CSⅠ和CSⅡ。然后,利用转基因技术,将柠檬酸合酶基因单个(CSⅠ)或联合(CSⅠ和CSⅡ)导入紫花苜蓿中,并对转化细胞耐铝胁迫的相关指标(细胞ATP酶活和细胞活力)进行了测定。结果表明,紫花苜蓿转柠檬酸合酶基因,能够有效缓解铝胁迫对紫花苜蓿悬浮培养细胞ATP酶的活性及细胞活力的影响,其中转双价CS基因(CSⅠ和CSⅡ)的效果优于转单个CSⅠ基因(P<0.05)。