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内毒素(endotoxin)是存在于革兰阴性菌细胞壁外膜上的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)成分。内毒素血症(endotoxemia,ETM)参与了临床多种疾病的发生、发展,如脓毒症、烧伤、急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、急慢性肝病、重症胰腺炎等,严重时可导致感染性休克(septic shock)、弥漫性血管内凝血(DIC)及多器官功能障碍(MODS)。目前认为,单核/巨噬细胞系统是内毒素作用的主要靶细胞,也是产生内毒素耐受的主要效应细胞。Toll样受体4(TLR4)在内毒素的信号转导中起重要作用。而IL-1受体相关激酶-M(IRAK-M)则是信号传导途径中重要的负调节因子。血必净注射液是由红花、赤芍、川芎、丹参、当归等活血化瘀中药提取而成。目前国内研究报道,该药能直接拮抗内毒素,减少内源性炎性介质的失控性释放,改善微循环,保护和修复应激状态下受损的脏器,有效降低脓毒症(sepsis)及其他原因所致的MODS的死亡率。本研究课题旨在通过体外试验客观评价血必净的“毒、炎”并治的效果。第一部分血必净直接中和或拮抗内毒素作用的体外研究目的:了解血必净体外有无直接中和或拮抗内毒素的作用。方法:将不同浓度的血必净和标准内毒素混合后进行水浴,再利用鲎试验(显色基质法)检测混合液中的内毒素含量。结果:随着血必净浓度的增加,与阳性对照组相比,内毒素含量反有上升,但差异无统计学意义(p＞0.05)。而随着水浴时间的延长,各实验组内毒素水平均呈现下降趋势,但差异尚无统计学意义(p＞0.05)。结论:血必净体外无直接中和或拮抗内毒素的作用。第二部分血必净对内毒素刺激的THP-1细胞的影响目的:了解血必净能否阻断内毒素刺激的THP-1细胞TNF-α的分泌;进一步探究可能的作用机制,是否与阻断内毒素信号转导或诱导内毒素耐受有关。方法:预先用不同浓度的血必净(以10、25、50mg/ml为浓度梯度)处理THP-1细胞,对照组不添加血必净,作用不同时间后(分别为4、12、24小时),再用10ng/ml的内毒素刺激THP-1细胞4小时。ELISA法测定上清液中TNF-α水平;抽提各组细胞总RNA,用实时定量PCR法测定并比较各组细胞TLR4和IRAK-M mRNA的表达差异。结果:(1)在不同浓度血必净及不同时间作用下,各实验组细胞TNF-α分泌水平均无明显变化(p＞0.05)。(2)只有在作用24小时时,TLR4表达才随着血必净浓度的增加而略有上调,但与对照组比较差异仍无统计学意义;而在50mg/ml浓度组,24小时的TLR4表达是4小时的1.547倍,差异有统计学意义(p＜0.05)。(3)作用4小时及12小时时,各浓度血必净组与对照组IRAK-M表达均无明显差异;但延长至24小时后,高浓度(50mg/ml)血必净组IRAK-M表达上调,是对照组的1.349倍(p＜0.05),而低、中浓度组与对照组之间无明显差异;并且,在高浓度血必净组,随着作用时间的延长IRAK-M表达也有上调,但差异尚无统计学意义(p＞0.05)。结论:(1)血必净不能阻断内毒素刺激的THP-1细胞TNF-α的分泌。(2)高浓度血必净长时间作用可能同时上调THP-1细胞TLR4和IRAK-M mRNA的表达,但确切含义仍不清楚。