病原菌毒力岛是指编码细菌毒力基因簇的分子量较大的染色体DNA片段。通过基因水平转移，细菌获得毒力岛基因。毒力岛编码不同功能的毒力相关基因，影响细菌的毒力变化。毒力岛的转移对宿主菌的致病能力或性状改变显著，且与细菌进化和新病原菌出现有关。PG0839基因是牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis，P.gingivalis)W83菌株PG0819-0844毒力岛中的重要部分。在慢性牙周炎患者 P.gingivalis阳性的龈下菌斑标本中，毒力岛基因PG0839检出与牙周探诊深度和探诊出血指数之间存在统计学意义，提示该基因可能是慢性牙周炎的致病性基因。目前许多学者通过反向遗传学方法进行基因功能研究，即构建目的基因敲除菌株后，通过对突变株表型变化的研究，获得目的基因与细菌表型之间的相关性，从而获知基因的功能。本研究拟遵循反向遗传技术路线，运用等位基因重组技术构建P.gingivalis PG0839基因突变菌株P.gingivalis W83-PG0839，并通过PCR和反转录PCR对突变株进行检测验证。同时，针对P.gingivalis W83-PG0839菌株的生物学特性以及PG0839基因毒力进行研究，为进一步明确毒力岛基因PG0839的功能提供实验依据。　　 材料和方法：　　 一、实验材料　　 1、主要试剂、仪器BHI培养基(Difco Laboratories，美国)天净沙细菌RNA OUT试剂盒(天泽基因工程有限公司)PrimeSTAR HS DNA Polymerase，DNA片段纯化试剂盒，DL2000 DNAMarker，λ-HindⅢDNA Marker，质粒小量提取试剂盒，DNA凝胶回收试剂盒，引物(大连宝生物工程有限公司)PCR扩增仪(TGRADIENT，Biometra公司，德国)自动凝胶成像分析仪(GDS8000，UVP公司，美国)厌氧培养箱(LY-Ⅰ型，沈阳医疗器械研究所)电穿孔仪(ECM630，BTX公司，美国)2、实验菌株本次研究采用了5种菌株：P.gingivalis ATCC33277、P.gingivalis W83、P。gingivalis W83-PG0839、大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)JM109和变形链球菌(Streptococcus mutans，S.mutans)ATCC2517。　　 p.gingivalis W83由美国佛罗里达大学牙科学院口腔微生物研究所LamontRJ教授惠赠，P.gingivalis ATCC33277和S.mutans ATCC2517由首都医科大学口腔医院提供，P.gingivalis W83-PG0839菌株由本次实验构建，E.coli JM109购自大连宝生物工程有限公司。　　 二、实验方法　　 1、受试对象和受试位点的选择选取2005年2月至2006年11月在中国医科大学口腔医学院牙周科门诊就诊慢性牙周炎患者90例。每例患者随机选取3个受试位点，共有259颗牙的270个受试位点纳入本研究。　　 2、龈下菌斑样本的采集记录受试位点的牙周探诊深度(probing depth，PD)、临床附着丧失(clinicalattachment loss，CAL)和探诊出血(bleeding on probing，BOP)情况。去除受试牙的龈上菌斑，棉卷隔湿。用无菌牙签取适量龈下菌斑，1 ml无菌磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)保存。　　 3、龈下菌斑样本的P.gingivalis检测应用 P.gingivalis16S rRNA特异性引物序列进行PCR扩增，预期产物片段长度为197 bp。　　 4、P.gingivalis阳性标本的PG0836、PG0838和PG0839基因的检测设计PG0836、PG0838和PG0839基因特异性引物，对P.gingivalis阳性标本PCR扩增后，预期产物片段长度分别为249 bp、331 bp和134 bp。　　 5、突变株构建(1)细菌培养P.gingivalis W83菌株接种于新鲜配制的含5％无菌脱纤维羊血，1%氯化血红素和维生素K(0.5μg/ml)的脑心浸液培养基(brain heart infusion，BHI)，37℃厌氧培养5-7天。E.coli JM109菌株接种于Luria-Bertani(LB)培养基，37℃需氧培养。　　 (2)pPG0839-1质粒构建设计PG0839基因特异性引物，扩增PG0839基因片段。预期产物片段为1584 bp，包含PG0839全长基因和部分上游和下游的非编码DNA片段。对PCR产物和pUC19载体进行BamIHⅠ和EcoRⅠ双酶切，回收、连接酶切产物后，热转化至E.coli JM109感受态细胞。氨苄青霉素(ampicillin，Amp)抗性培养基筛选阳性克隆，增菌，提取质粒pPG0839-1A，测序。测序结果显示pPG0839-1A基因编码区内存在1点突变。委托宝生物公司进行点突变修复后测序，结果显示基因编码区与参考序列一致，将该质粒命名为pPG0839-1。　　 (3)红霉素抗性基因(erythromycin，erm)扩增使用erm特异性引物对质粒pVA9812 DNA进行PCR扩增，预期产物片段为2101 bp。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。回收PCR产物，加“A”，纯化。将精制后的PCR产物和pMD19-T simple载体连接，热转化至E.coli JM109，涂布平板。使用菌落PCR筛选阳性克隆后，增菌提取质粒pErm DNA，测序。使用StuⅠ对质粒pErm进行酶切后，回收纯化得到2101 bp erm基因片段。　　 (4)pPG0839-2质粒构建使用EcoR V对质粒pPG0839-1进行酶切后，凝胶回收得到pPG0839-1-EcoR V片段。将纯化酶切产物进行去磷酸化处理后，凝胶回收得到3.7 kb的pPG0839-1-EcoR V(BAP)片段。连接pPG0839-1-EcoR V(BAP)和erm基因片段，热转化至E.coli JM109，Amp抗性培养基筛选阳性克隆后，增菌提取质粒DNA，HindⅢ进行正反向酶切鉴定，测序，将质粒命名为pPG0839-2。　　 (5)载体电穿孔转化及突变株筛选将100μl P.gingivalis细胞悬液和1μgpPG0839-2 DNA加入一个无菌电极杯，电穿孔脉冲为2440 V，5 ms。将电穿孔后细胞悬液接种于1ml BHI液体培养基，37℃厌氧培养16 h后，将菌液接种于抗性BHI培养基(含5μg/ml红霉素)，37℃厌氧培养7天后收集阳性克隆，命名为P.gingivalisW83-PG083906、突变株的检测(1)PCR检测分别使用P.gingivalis16S rRNA引物、erm基因引物和PG0839基因引物对P.gingivalis W83-PG0839 DNA进行PCR检测。　　 (2)反转录PCR检测根据PG0839基因编码序列设计引物，预期产物片段为742 bp，对P.gingivalis W83-PG0839 RNA进行反转录PCR检测。　　 7、P.gingivalis W83-PG0839生物学特性观察培养P.gingivalis W83和W83-PG0839菌株。观察两菌株菌落形态特征和革兰染色镜下特征。观测、绘制两菌株的生长曲线。制备1%绵羊红细胞，取OD600为1.5的P.gingivalis W83和W83-PG0839细菌细胞，进行绵羊红细胞凝集活性检测。　　 8、PG0839在小鼠模型中的毒力作用将昆明小鼠随机分为7组，每组8只。组1-3为P.gingivalis W83组(接种菌液浓度分别为2×1010、1×1010、5×109 CFU/ml)，组4-6为P.gingivalis W83-PG0839组(接种菌液浓度分别为2×1010、1×1010、5×109 CFU/ml)，组7为对照组(接种无菌PBS)。在组1-6中每只小鼠背部皮下两个位点皮下注射0.1 ml的细菌悬液。每日观测两次，记录小鼠的健康状态和病损大小，2周后处死所有小鼠。　　 采用皮尔森(Pearson)卡方检验对不同牙周状态下基因的检出率和不同组别小鼠生存率进行比较。采用对数秩检验对不同组别小鼠生存情况进行分析。　　 9、PG0839基因对口腔上皮细胞产生炎症因子的影响培养P.gingivalis W83和W83-PG0839菌株，将菌悬液浓度调至1×108CFU/ml。使用含10%小牛血清的低糖Dulbeccos改良细胞培养基(Dulbeccosmodified eagle medium，DMEM)培养KB细胞。使用P.gingivalis感染KB细胞，命名为实验组1；使用W83-PG0839菌株感染KB细胞，命名为实验组2；对照组为未受细菌感染的KB细胞。将P.gingivalis与KB细胞共同孵育24 h，分别在0.5h、2h、6h、12 h和24 h时，置入Trizol保存。　　 提取细胞RNA。应用白细胞介素-1β(interleukin-1，IL-1β)、IL-6、Toll样受体-4(Toll like recepector-4，TLR-4)特异性引物对各组RNA进行反转录PCR检测，使用β-actin引物作为内参。采用单因素方差分析和T检验方法对不同组别的PCR产物灰度值进行比较。　　 结果：　　 1、慢性牙周炎患者P.gingivalis检测结果在慢性牙周炎患者的龈下菌斑标本中，P.gingivalis检出率为74.44%。　　 2、PG0836、PG0838和PG0839基因的检测结果在P.gingivalis阳性的龈下菌斑中，PG0836、PG0838和PG0839基因检出率分别为66.17%、24.88%和27.86%。　　 3、PG0836、PG0838和PG0839基因检出与临床牙周指数的关系在不同牙周临床指数水平，PG0836和PG0838基因检出率无显著差异(P>0.05)。　　 BOP阳性位点的PG0839基因检出率(28.35%)显著高于BOP阴性位点(14.29%，x2=5.91，P<0.05)；随着牙周袋深度增加，PG0839基因的检出率呈现增高趋势(P<0.05)。　　 4、P.gingivalis W83-PG0839突变菌株的构建和检测使用1584 bp PG0839基因产物和pUC19载体构建质粒pPG0839-1。将2101bperm基因产物插入到pPG0839-1中PG0839基因的EcoR V位点，构建质粒pPG0839-2，作为电穿孔的供体质粒。电穿孔后，使用红霉素抗性培养基筛选阳性克隆，命名为P.gingivalis W83-PG0839。使用P.gingivalis16S rRNA特异性引物进行PCR扩增，结果显示P.gingivalis W83-PG0839菌株为牙龈卟啉单胞菌。使用erm基因引物PCR进行扩增，结果显示P.gingivalis W83-PG0839菌株基因组DNA中存在erm基因片段。使用PG0839基因引物进行PCR扩增，结果显示该菌株基因组DNA中存在插入了2101bp的erm基因的PG0839基因片段。使用PG0839基因引物进行反转录PCR扩增，结果显示该菌株PG0839基因未转录为相应的RNA。　　 5、菌株生物学特性观察(1)菌落形态观察P.gingivalis W83-PG0839菌株形成白色、光滑的圆形菌落。两菌株革兰染色后镜下形态相同，均为杆状。　　 (2)菌株生长情况观察 P.gingivalis W83-PG0839菌株的生长速度低于P。gingivalis W83，但是两组数据缺乏显著性差异(U=25.50，P=0.19)。　　 (3)绵羊红细胞凝集活性研究结果P.gingivalis W83-PG0839菌株的红细胞凝集活性显著降低。　　 6、PG0839基因对小鼠模型的毒力研究接种5×109 CFU/ml P.gingivalis W83细菌的小鼠生存时间短于接种W83-PG0839细菌的小鼠，但是两组数据无显著性差异(x2=1.87，P=0.17)。在1×1010 CFU/ml和2×1010 CFU/ml细菌接种水平，两组生存时间存在显著性差异(P<0.05)。　　 在5×109 CFU/ml细菌接种水平，接种P.gingivalis W83细菌的小鼠生存率随时间延长逐渐降低，生存率低于接种W83-PG0839细菌的小鼠(P>0.05)。在1×1010和2×1010 CFU/ml这两个细菌接种水平，随着时间的延长，两组小鼠生存率逐渐下降，接种P.gingivalis W83细菌的小鼠生存率显著低于接种P.gingivalisW83-PG0839细菌的小鼠(P<0.05)。　　 7、PG0839基因对口腔上皮细胞产生炎症因子的影响当细菌和细胞共同孵育0.5 h到6h，实验组1的IL-1β和TLR-4 mRNA表达水平呈现时间依赖性增长，在6h时IL-1β和TLR-4 mRNA表达水平达到最高值。随后，两炎症因子mRNA表达水平逐渐下降。在实验组2中，IL-1β和TLR-4 mRNA表达水平未呈现时间依赖性变化。在24 h内，两实验组的IL-6 mRNA表达水平与对照组相近。　　 结论：　　 1、在P.gingivalis检测阳性的龈下菌斑标本中，毒力岛基因PG0836和PG0838的检出与牙周袋深度、临床附着丧失和探诊出血无关，提示PG0836和PG0838基因可能与P.gingivalis的致病性无关。　　 2、在P.gingivalis检测阳性的龈下菌斑标本中，毒力岛基因PG0839检出与牙周袋深度和探诊出血指数之间存在统计学意义，提示该基因可能在P.gingivalis致病过程中发挥一定的作用，为牙周病致病性基因。　　 3、运用等位基因同源重组技术构建P.gingivalis PG0839基因突变菌株，命名为P.gingivalis W83-PG0839。通过PCR和反转录PCR反应对P.gingivalisW83-PG0839菌株进行检测验证，证实PG0839基因突变菌株构建成功。　　 4、与P.gingivalis W83比较，P.gingivalis W83-PG0839菌株产生黑色素和红细胞凝集活性显著降低。两菌株生长曲线和镜下形态之间未见显著性差异。结果表明PG0839基因的缺失改变了细菌的一些生物学特征，提示PG0839基因可能调控牙龈卟啉单胞菌某些基因或者基因产物的表达。　　 5、小鼠皮下感染模型表明P.gingivalis W83-PG0839菌株毒性显著低于W83菌株，结果提示PG0839基因在P.gingivalis致病过程中发挥一定的作用。　　 6、P.gingivalis感染KB细胞实验结果提示PG0839基因在P.gingivalis引发KB细胞炎症过程中发挥作用。