肝癌是的发病率和死亡率分别居恶性肿瘤第6和第3位。全球每年新发病例约62.6万，死亡约59.8万。深入研究肝癌的发病机制，了解其生物学特性，是寻找肝痛新的诊断标志物和治疗靶点的基础。　　 MicroRNA(miRNA)是一类长度为17～25个核苷酸的非编码小分子RNA，在转录后调节靶基因的表达，从而影响多种生物学功能。根据所调控靶基因功能的不同，miRNA具有抑癌基因和癌基因的双重作用。miRNA的表达谱与肿瘤的类型相关，不同类型的肿瘤具有明显相互区别的miRNA表达谱，提示miRNA可以作为肿瘤分类的标志物，并可用于肿瘤的治疗和预后判断。microRNA对靶基因的调节主要通过与靶基因的3非编码区互补结合(3-UTR)，调控蛋白的翻译。其对细胞功能的调控与其调节的靶基因功能相关。　　 miR-106b属于miR-106b～25基因簇，由miR-106b、miR-93及miR-25组成，编码基因染色体定位于7q22.1。对不同组织来源的肿瘤miRNA表达谱分析发现，miR-106b在多种肿瘤组织及肿痛细胞株中都高表达，包括头颈部鳞癌、结肠癌、髓母细胞瘤、食管癌、多发性骨髓瘤、肝癌等。　　 Wnt/β-catenin(简称Wnt)信号传导通路是一条在生物进化中极为保守的通路。其中β-catenin是该通路的关键效应分子，正常情况下其在胞浆中含量很少，因为大量的β-catenin蛋白被axin/GSK-3/APC多蛋白复合物磷酸化后，通过泛蛋白化途径被降解。而当Wnt蛋白与细胞表面受体Frizzled结合后，受体激活Dishevelled家族蛋白，最终导致细胞巾β-catenin增加。胞浆中增加的β-catenin就可以进入细胞核，与TCF/LEF家族转录因子相互作用，促进特定基因表达。而在β-catenin含量调节中，APC蛋白起着非常重要的作用。APC基因(Adenomatouspolyposiscoli,APC)是家族性结肠息肉痛(falIlilyadenomatouspolyposis，FAP)以及散发性结肠痛的抑癌基因，该基因的突变与结肠癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、食道癌的发生有密切关系。APC蛋白可与β-连环蛋白(β-catenin)连接，促进β-catenin降解，如果APC受到抑制，则β-catenin在细胞浆内积累，积累达一定量后，可进入细胞核，与T细胞因子TCF结合，促进相关基因的表达。因此APC被认为是一种抑癌基因，在多种细胞过程中起作用。APC的作用在调节Wnt/β-catenin信号通路中的作用非常重要。　　 因此在本研究中，我们通过检测miR-106b在肝细胞癌中的作用及机制。与正常肝组织和肝上皮细胞相比，肝癌组织和细胞株中miR-106b的表达显著升高。外源性表达miR-106b可促进细胞增殖，并引起细胞由G1期向S期转化;而抑制miR-106b则抑制细胞增殖，并引起G0/G1期阻滞。荧光素酶报告基因检测发现，miR-106b通过靶向Wnt/β-catenin信号通路中的APC基因，抑制APC基因表达，从而导致胞浆中β-catenin增加，并进入细胞核内，从而引起其下游基因，如cyclinD1和pRB的激活，促进细胞增殖。发现miR-106b通过靶向APC基因3-UTR，抑制APC基因的表达及Wnt/β-catenin信号通路的活性，促进HCC细胞的增殖。推测miR-106b在HCC的发生发展中起重要作用，其可以成为HCC治疗的一个新的潜在靶点，并可用于HCC治疗和预后，以及疾病监测的重要指标。　　 方法：　　 1.分析miR-106b在肝癌细胞株和肝癌组织中表达情况。首先采用Real-timePCR方法检测8个HCC细胞株(HepG2，QGY-7703，BEL-7402，MHCC97H，HCCC-9810，Hep3B，MHCC97L和Huh7细胞)与正常肝上皮细胞株(NLEC)中miR-106表达的差异;并选取8例HCC病例，检测肝癌组织和邻近非肿瘤组织中miR-106b表达的差异;并与NCBI/GEO中有关miR-106在肝癌中表达检测进行比对。　　 2.检测外源性表达miR-106b对HCC细胞增殖的影响。通过构建含有miR-106b的pcDNA3.1质粒，转染QGY-7703和HepG2细胞，在细胞中过表达miR-106b，应用MTT方法，检测miR-106b对细胞增殖速率的影响;应用克隆形成实验，检测miR-106b过表达对QGY-7703和HepG2细胞克隆形成能力的影响;应用软琼脂增殖实验，检测miR-106b过表达，对细胞不依赖锚定生长能力的影响，该不依赖锚定生长是恶性肿瘤迁徙性增强的显著标志。　　 3.检测miR-106b对HCC细胞周期的影响。应用BrdU掺入实验，检测在QGY-7703和HepG2细胞中过表达miR-106b，细胞新和成DNA的能力;应用流式细胞仪检测过表达miR-106b对细胞周期的影响，特别是对G1/S转变的影响。　　 4.抑制miR-106b对HCC细胞增殖的影响。构建miR-106b抑制序列，转染QGY-7703和HepG2细胞，同样应用MTT实验，克隆形成实验，以及软琼脂增殖实验，检测抑制miR-106b对HCC细胞增殖速率的影响。　　 5.检测抑制miR-106b对细胞周期的影响。检测抑制miR-106b对BrdU竞争性掺入的影响，并用流式细胞仪检测抑制miR-106b对细胞周期的影响。　　 6.miR-106b对cyclinD1，pRb细胞周期蛋白表达的影响。Westernblotting方法检测miR-106b过表达和抑制miR-106b表达对Wnt通路下游信号cyclinD1和pRb蛋白表达的影响;并应用Real-timePCR方法检测cyclinD1mRNA水平的改变，检测miR-106b对cyclinD1表达的影响。　　 7.TOP/FOP荧光素酶检测miR-106b对Wnt/β-catenin信号通路的影响。TOP/FOP荧光素酶检测是Wnt/β-catenin信号通路其下游TCF-4活性的经典试验。TOP/FOPFLASH质粒购自美国Milipore公司。检测miR-106b过表达和抑制miR-106b表达对TOP/FOP荧光比例的影响。　　 8.miR-106b对Wnt/β-catenin信号通路下游分子的影响。Real-timePCR方法检测Wnt/β-catenin信号通路下游调节靶基因MYC，CYR61，CD44，Snail，TCF4，RUNX2等的mRNA表达水平改变。　　 9.miR-106b对β-catenin在细胞内定位的影响。分离细胞浆和胞核蛋白，Westernblotting方法检测胞浆和胞核中β-catenin表达情况。以p84作为核蛋白标志，EF-1α作为蛋白上样标准。　　 10.抑制Wnt/β-catenin信号通路下游TCF4分子，对miR-106b在HCC细胞周期影响中的作用。流式细胞仪检测同时抑制TCF4和过表达miR-106b对HCC细胞周期的影响，进而检测抑制TCF4后，过表达miR-106b对细胞周期的影响。　　 11.miR-106b在HCC细胞中的直接作用靶点。经理论计算，miR-106b的靶分子是APC蛋白。Westernblotting方法检测过表达miR-106b和抑制miR-106b对APC蛋白表达的影响。并进一步检测miR-106b对APC的抑制是通过APC的3-UTR进行，我们将包含两个miR-106b结合位点的APC-3-UTR片段克隆到pEGFP-C3和pGL3双荧光素酶的报告载体中，检测AP.C-3-UTR片段对miR-106b过表达所引起的GFP表达的影响。并检测不同剂量的miR-106b过表达和抑制其表达，对荧光素酶表达的影响。进而构建APC-3-UTR片段的突变体，再次检测其对miR-106b过表达和抑制其表达后，对荧光表达的影响，以确定APC是否是miR-106b作用的直接靶点。　　 12.抑制APC表达，对miR-106b所致的细胞增殖和周期转变的影响。应用siRNA方法，沉默APC基因表达，再同时过表达miR-106b或抑制miR-106b，检测细胞周期，BrdU掺入实验的改变，探讨APC在miR-106b在诱导细胞增殖中的作用机制。　　 结果：　　 1.在HCC细胞株和HCC组织中，miR-106的表达显著上调。Real-timePCR结果显示，所研究的HCC细胞株与正常肝上皮细胞相比，miR-106b的表达都显著上调（各组增长倍数的99.375％置信区间均不包括1）。所有8例肝癌组织中，miR-106b的表达量与邻近的非肿瘤组织miR-106b的表达量的比值最小为5.767±0.513，说明在肝癌组织和肝癌细胞株中，miR-106b的表达上调，与NCBI/GEO/GSE31384研究结果一致。　　 2.外源性过表达miR-106b，促进细胞增殖。外源性过表达miR-106b，MTT结果显示，上调miR-106b显著增加QGY-7703和HepG2细胞的增殖速度(F=541.794，P=0.000)。克隆形成实验结果证实miR-106b上调促进HCC细胞{QGY-7703(t=26.704=0.000)和HepG2(t=21.992,P=0.000)细胞，}增殖的作用，差异有统计学意义（P＜0.05）。软琼脂增殖实验显示，大于0.1mm的克隆数，HCC细胞{QGY-7703(t=18.614,P=0.000)和HepG2(t=16.444,P=0.000)细胞，｝明显多于正常细胞，证实过表达miR-106b可以增强HCC细胞不依赖锚定生长的能力，可以促进肿瘤的转移和迁徙。而BrdU掺入实验结果提示，与对照组相比，QGY-7703细胞中过表达miR-106b，Brdu阳性细胞显著增高(t=12.518，P=0.000)，可以显著增加S期细胞的比例，S期细胞比例从31.04％增加到57.22％;同样在HepG2细胞中得到相似结果，过表达miR-106b，Brdu阳性细胞显著增高(t=11.767，P=0.000)，使S期细胞的比例从29.93％增加到56.76％。流式细胞仪检测结果与以上结果一致，过表达miR-106b，使得S期细胞比例显著上调，促进G1/S期转化，促进细胞增殖。　　 3.抑制miR-106b表达，则可抑制HCC细胞增殖。构建miR-106b抑制序列，在QGY-7703和HepG2细胞中抑制miR-106b的表达，MTT实验显示，QGY-7703细胞(t=10.354，P=0.000)和在HepG2细胞(t=8.136，P=0.000)中抑制miR-106b表达，可以显著抑制细胞的增殖速率。克隆形成实验显示，QGY-7703细胞(t=45.226,P=0.000)和HepG2细胞(t=54.177，P=0.000)中抑制miR-106b表达，可以显著抑制细胞的增殖速率。不依赖锚定生长能力检测结果提示，QGY-7703细胞（t=10.099，P=0.000）和HepG2细胞(t=10.123，P=0.000)中抑制miR-106b表达，显著抑制不依赖锚定生长能力，克隆形成的数目和体积都明显下降。　　 与此结果一致，BrdU掺入实验和流式细胞仪检测记过提示，抑制miR-106b的表达，QGY-7703细胞(t=8.539，P=0.000)和HepG2细胞(t=6.745，P=0.000)中Brdu阳性细胞明显降低，可以显著降低S期细胞的比例，抑制细胞新和成DNA的能力，并使得细胞产生G0/G1期阻滞。　　 4.miR-106b促进HCC细胞增殖通过激活Wnt/β-catenin信号通路实现。　　 TOP/FOP荧光素酶比例检测，是检测Wnt/β-catenin信号通路活性的经典实验，在本研究中发现，QGY-7703和HepG2细胞中过表达miR-106b，导致细胞中TOP/FOP荧光素酶表达比例显著升高（TOP/FOP荧光素酶比值的均值介于3.633～4.090之间，各组增长倍数的97.5％可信区间均不包括1）;而抑制miR-106b表达，则抑制TOP/FOP荧光素酶表达比例（TOP/FOP荧光素酶比值的均值介于0.333～0.370之间，各组增长倍数的97.5％可信区间均不包括1），提示miR-106b的过表达可以激活Wnt/β-catenin信号通路。　　 同时应用Westernblotting方法检测Wnt/β-catenin信号通路下游的cyclinD1、pRb蛋白及其磷酸化形式的表达，结果显示:过表达miR-106b的肝癌细胞中cyclinD1、磷酸化pRb(p-pRb)表达水平上调;Real-timePCR结果显示，miR-106b提高cyclinD1的mRNA水平（转染miR-106b肝癌细胞cyclinD1的表达量与正常肝上皮细胞表达量比值的均值介于4.050～4.067之间，各组增长倍数的98.33％置信区间均不包括1）;并且增加Wnt/β-catenin信号通路下游分子，如MYC，CYR61，CD44，Snail，TCF4，RUNX2的表达（转染miR-106b肝癌细胞巾6个经典靶基因的mRNA表达量与正常肝上皮细胞表达量比值的均值介于2.457～7.520之间，各组增长倍数的97.50％置信区间均不包括1）。　　 Wnt/β-catenin信号通路的激活，促进胞浆中β-catenin的积累，并促进其进入细胞核内，因此我们通过分离细胞浆和细胞核内蛋白，Westernblotting结果显示，过表达miR-106b，显著上调细胞核内β-catenin的表达;而抑制miR-106b的表达，则胞核中β-catenin的含量显著下降。　　 5.抑制Wnt/β-catenin信号通路下游关键分子TCF4，对miR-106b在HCC细胞中作用的影响。为了研究miR-106b对HCC细胞周期的调节作用是否通过激活Wnt/β-catenin信号通路产生，我们抑制Wnt/β-catenin信号通路下游的关键分子TCF4，结果提示，抑制TCF4，可以逆转miR-106b所引起的S期细胞比例增加，抑制细胞G1/S期转变。以上结果提示，miR-106b促进HCC细胞增殖，细胞周期G1/S期转化的作用是通过激活Wnt/β-catenin信号通路所实现的。　　 6.APC蛋白是miR-106b作用的直接靶点。APC蛋白在Wnt/β-catenin信号通路活性调节中发挥重要作用，为了研究miR-106b激活Wnt/β-catenin信号通路的机制，我们分析了miR-106b可能的作用靶点，计算结果提示，APC蛋白的3-UTR片段与miR-106b互补，提示APC可能是miR-106b的作用靶点。　　 实验验证中首先我们检测miR-106b对APC蛋白表达的影响，Westernblotting结果显示，过表达miR-106b显著抑制APC蛋白的表达，而抑制miR-106b的表达，则APC的表达上调。双荧光素酶报告载体显示，miR-106b仅抑制包含APC-3-UTR载体的GFP荧光表达提示miR-106b特异地靶向APC的3-UTR，从而下调APC的表达。　　 7.miR-106b直接靶向APC基因的3-UTR，抑制APC基因的表达。构建含有miR-106结合位点的APC基因3-UTR片段的GFP表达质粒，结果提示，miR-106b可以抑制APC基因的GFP荧光表达，而对α-tubulin的GFP表达没有影响。同时发现，应用不同剂量的miR-106b(10nM和50nM)，同时转染包含APC-3-UTR片段，检测发现荧光素酶活性与对照组相比的比值的均值介于0.237～0.593之间，各组增长倍数的98.75％置信区间均不包括1，而转染miR-106b抑制质粒（同时转染包含APC-3-UTR片段，检测发现荧光素酶活性与对照组相比的比值的均值介于1.950～3.317之间，各组增长倍数的98.75％置信区间均不包括1，说明miR-106b呈剂量依赖地方式抑制APC基因3-UTR片段的荧光表达，而抑制miR-106b表达，则可以促进荧光的表达。　　 构建APC-3-UTR片段突变的表达质粒(APC-3-UTR-dn)，荧光素酶报告检测结果显示:miR-106b可以抑制荧光素酶的表达，而APC-3-UTR-mu，可以消除miR-106b所引起的荧光素酶表达抑制作用。　　 以上结果提示，APC是miR-106b的靶基因，miR-106b通过靶向APC的3-UTR区域，靶向抑制APC的表达。　　 8.APC在miR-106b所致的HCC细胞增殖中发挥重要作用。为了进一步检测APC在miR-106b所引起的HCC细胞增殖中的作用，我们首先利用siRNA沉默APC表达，再共转染miR-106b，检测其对HCC细胞增殖的影响，结果发现，抑制APC，可以显著增加BrdU阳性率（HepG2细胞中，F=41.148，P-=0.000;QGY-7703细胞中，F=24.561，P=0.000）。结果提示，抑制APC表达，促进细胞增殖。抑制miR-106b表达，并同时沉默APC基因表达，则BrdU阳性细胞比例显著上调（HepG2细胞，F=123.126，P=0.000;QGY-7703细胞，方差不齐，采用Welch校正后，F=12.613，P=0.000）。这些结果说明，抑制APC基因表达，则逆转了抑制miR-106b表达，抑制细胞增殖的作用。进一步证实，miR-106b是通过APC基因其作用。综上所述，我们的结果证实APC在miR-106b所诱导的HCC细胞增殖中发挥重要作用。　　 结论：　　 miR-106b过表达促进HCC细胞增殖，增强HCC细胞的克隆形成和不依赖锚定生长的能力，在肿瘤的转移中发挥重要作用;抑制miR-106b则可以逆转其促进细胞增殖的作用。　　 miR-106b促进HCC细胞增殖的作用机制是通过激活Wnt/β-catenin信号通路所实现。MiR-106b表达促进TOP/FOP荧光素酶的比例，并增加Wnt/β-catenin信号通路下游分子cyclinD1，p-pRb的表达，以及下游MYC，CYR61，CD44，Snail，TCF4，RUNX2基因的表达。并促进MYC，CYR61，CD44，Snail，TCF4，RUNX2基因的表达，并促进β-catenin向细胞核内转移。而抑制Wnt/β-catenin信号通路下游重要的效应分子TCF4，则可以逆转miR-106b所引起的细胞周期转化作用，逆转miR-106b促进细胞增殖的作用。　　 理论预测，Wnt/β-catenin信号通路中重要的分子，APC蛋白是miR-106b的重要靶分子。研究结果显示，miR-106b不仅可以抑制APC蛋白的表达，还呈剂量依赖的方式抑制包含APC-3-UTR片段的GFP荧光表达，而APC-3-UTR片段突变则可以逆转该作用。同时对细胞增殖和周期的影响检测发现，APC-3-UTR片段突变可以逆转miR-106b的促进细胞增殖，促进细胞周期G1/S期转变的作用。　　 因此，得出以下结论:miR-106b通过靶向抑制APC蛋白，激活Wnt/β-catenin信号通路，促进HCC细胞增殖。