目的:膀胱肿瘤是世界上排名第五的常见肿瘤。在大多数病例中,膀胱肿瘤起源于表面的移行细胞。膀胱癌患者的诊断与肿瘤细胞的侵袭以及迁移有关。然而,调节侵袭的相关分子机制还不完全清楚。尽管最近几年,许多有关膀胱癌的治疗策略不断出新,但是膀胱癌的整体存活率并没有显著提高。因此,研究膀胱肿瘤进展的潜在分子机制和相关通路仍然对于新的靶向治疗策略的问世十分重要。小GTP酶的Rab27家族调节着不同类型包括多泡核内体的胞外分泌,进而导致外泌体的释放,Rab27最近被发现在人类肿瘤的发展中发挥作用。Rab27能够促进雌激素受体(ER)阳性的乳腺癌细胞的侵袭性生长和迁移。Rab27被认为是在黑色素瘤的进展中能够提供生长优势的驱动基因。在黑色素瘤细胞系中抑制Rab27的表达能抑制异种移植肺转移小鼠模型的原发肿瘤的生长和发育。这些研究提示Rab27可能是人类肿瘤中的一个潜在的癌基因。然而,Rab27在人膀胱肿瘤中的表达模式和生物学行为还未曾被报道过。在本研究中,我们通过免疫组织化学方法检测了Rab27在膀胱肿瘤组织中的表达并分析Rab27的表达模式与膀胱癌临床病理因素之间的关系。此外通过双向调控Rab27在膀胱肿瘤细胞系中的表达分析了Rab27对细胞增殖和侵袭的影响。我们还探讨了影响Rab27发挥其生物学功能所依赖的潜在分子信号通路,为今后膀胱癌的靶向治疗提供坚实的科学依据。方法:患者与样本本次研究经过了中国医科大学伦理学会的批准。87例肿瘤组织取自于2011-2012年间在中国医科大学附属第一医院诊断为膀胱癌的患者。肿瘤组织用苏木精和伊红进行染色并根据世界卫生组织的分类指导原则对样本进行组织学诊断和肿瘤分级。根据WHO指南,将肿瘤样本分为Ta,T1,T2,T3以及T4。免疫组织化学肿瘤样本用10%的中性福尔马林进行固定并制备厚约4μm的切片。免疫组化实验使用福州迈新公司的Elivision staining试剂盒。切片经过二甲苯溶液脱蜡,浓度梯度酒精脱水,并在柠檬酸盐缓冲液中修复2分钟。用0.3%的过氧化氢溶液处理切片,抑制内源性过氧化物酶的活性水平,并用正常的山羊血清进行孵育,减少非特异性结合。接着进行抗体孵育。孵育完成后用DAB试剂盒进行染色。两位病理学家对样本进行双盲检测。每张切片选取5个视野,放大倍数为400倍。Rab27A的染色评分采用半定量的方法。肿瘤组织中Rab27A染色强度以及染色细胞百分比明显高于健康组织。肿瘤组织为免疫组化阳性染色。细胞培养与转染J82,RT4,BIU-87,T24以及5637细胞购买于美国典型培养物保藏中心。培养细胞用含有10%胎牛血清的1640培养基进行。培养细胞每隔两天进行传代,传代用0.25%的胰蛋白酶。On-Target Plus SMARTpool si RNAs for Rab27 and ON-TARGETplus Non-targeting si RNA#1购买于Dharmacon公司。细胞转染si RNA用Dharma FECT 1转染试剂。p CMV6-Rab27A质粒购买于Origene公司,转染试剂用Lipo3000。Western blot提取细胞总蛋白用lysis混合液,并用Bradford方法进行蛋白定量。50mg样本总蛋白通过SDS-PAGE进行分离,并转印于PVDF膜上。接着进行抗体孵育,孵育过后将PVDF膜用TBS缓冲液进行漂洗,并用ECL发光液进行发光,用凝胶成像仪进行观察和记录。CCK8实验分析细胞的增殖速度使用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒。将经过Rab27A转染以及干扰48小时后的细胞接种于96孔板中,接种密度为5×103每孔。连续培养细胞,每孔细胞中加入10μl CCK8溶液,继续再培养4小时,在酶标仪下检测OD值,检测波长为450nm。集落形成实验将经过Rab27A转染以及干扰的细胞接种于直径为6cm的培养皿中,每皿约1000个细胞。连续培养两周以后,将细胞用PBS缓冲液进行漂洗,并用吉母萨染色液进行染色。在显微镜下进行观察,细胞数目超过50即可记为一个克隆。基质胶侵袭实验基质胶侵袭实验用24孔Transwell培养板进行。将经过转染以及干扰的细胞进行常规消化,并用100μl无血清培养基进行重悬,制备细胞悬液。Transwell小室上室中加入细胞悬液,下室中加入含有15%胎牛血清的培养基。用棉签将留在上室,未侵入到下室的细胞清除。将侵入到下室的细胞用4%的多聚甲醛进行固定并用苏木精进行染色。在显微镜下进行观察。统计分析统计分析使用SPSS软件。Rab27A表达水平与临床病理意义之间的关系用c2检测方法进行分析。p﹤0.05表示两组之间存在显著差异。结果:Rab27A在人膀胱癌组织中表达上调,Rab27A高表达水平与肿瘤的T分级以及浸润深度(Ta-T1 vs T2-T4,p=0.0083)。通过免疫组织化学检测发现87例膀胱癌组织中有39例样本中存在Rab27过表达的现象,比例高达44.8%。Rab27蛋白质在膀胱癌细胞中定位于细胞浆。分析Rab27过表达与临床病理因素之间的关系发现,Rab27过表达与肿瘤侵袭深度/T分期显著相关(Ta-T1 vs T2-T4,p=0.0083),而与患者的年龄、性别以及肿瘤分级无显著相关性。Rab27促进人膀胱癌细胞系细胞增殖以及侵袭CCK8实验结果表明膀胱癌细胞系中Rab27转染能够提高细胞的增殖率,而Rab27敲除后则抑制细胞的增殖。集落形成实验表明Rab27转染后BIU-87细胞集落形成数目增多,Rab27干扰后得到相反结果。基质胶侵袭实验表明Rab27敲除后下调了穿过基底膜的细胞数目,而转染Rab27后穿过基底膜的细胞数目显著增多。Rab27对人膀胱癌细胞系细胞增殖侵袭相关蛋白的影响与调控应用Rab27转染人膀胱癌细胞系BIU-87,应用Rab27 si RNA干扰人膀胱癌细胞系5637。处理后的膀胱癌细胞系分别培养48小时。通过Western blot技术检测发现Rab27过表达上调了膀胱癌细胞系中周期蛋白cyclin D1,cyclin E的表达量,而敲除Rab27后膀胱癌细胞系中周期蛋白cyclin D1,cyclin E的表达量显著下调。Rab27对人膀胱癌细胞系中NF-κB and FAK信号通路的影响应用Rab27转染人膀胱癌细胞系BIU-87,应用Rab27 si RNA干扰人膀胱癌细胞系5637。处理后的膀胱癌细胞系分别培养48小时。通过Western blot技术检测发现Rab27过表达激活了FAK和NF-κB信号通路,上调了p-FAK(Tyr925),p-FAK(Tyr576/577)和p-IκB的表达水平。而敲除Rab27后,则下调了p-FAK(Tyr925),p-FAK(Tyr576/577)以及p-IκB的表达量。结论:Rab27在人膀胱癌组织中过表达并Rab27过表达并与肿瘤侵袭深度/T分期显著相关(Ta-T1 vs T2-T4,p=0.0083),而与患者的年龄、性别以及肿瘤分级无显著相关性。Rab27通过上调周期蛋白cyclin E,cyclin D1的表达而促进细胞的增殖和侵袭。Rab27激活NF-κB以及FAK信号通路活性。