论文部分内容阅读
[目的]:本文通过研究自体富含血小板血浆(PRP)对内皮祖细胞增殖、迁移、粘附及分化的影响,以期获得一种安全有效的内皮祖细胞(EPCs)扩增方法。[方法]:通过手动离心法获得富含血小板血浆,并通过草酸铵法计算血小板回收率及富集率评估PRP质量。通过外周血离心并体外培养获取内皮祖细胞。采用CD31免疫荧光染色、DiI-AC-LDL吞噬实验和FITC-UEA-1结合实验进行免疫学鉴定。将实验基本分为ECM、ECM+配套生长因子、ECM+PRP(10ul/ml),ECM组只含ECM基础培养基+5%胎牛血清+1%双抗,不加入配套的生长因子添加剂。ECM+配套生长因子组即为ECM完全培养基,ECM+PRP组为ECM组基础上增加激活PRP萃取液(10ul/ml)。通过MTT法检测细胞活性,Transwell小室及细胞粘附实验检测细胞迁移及粘附功能。通过RT-PCR法检测细胞CD34、CD45分子表达情况从而了解PRP对EPCs分化的影响。在RT-PCR实验中,增加利用ECM完全培养基原代培养7-9天的贴壁细胞作为原代细胞组。[结果]:全血中血小板浓度约为164.43±14.69(×109)(N=12),血小板浓聚物浓度约为1045.24±99.36(×109)(N=12),血小板回收率约为79%,富集率约为6.36(×102)。试验细胞CD31荧光染色、吞噬DiI-AC-LDL和结合FITC-UEA-1荧光染色呈阳性,证实为EPCs。MTT法结果:第一天ECM组(0.18±0.139)、ECM+配套生长因子组(0.22±0.020)、ECM+PRP(10ul/ml)(0.22±0.198)组整体比较有统计学意义(P<0.01)(N=12)。ECM+PRP(10ul/ml)组与ECM+配套生长因子组两两比较无统计学差异,ECM+PRP(10ul/ml)组、ECM+配套生长因子组各与ECM组两两比较均有统计学差异(P<0.01)。第7天ECM+PRP(10ul/ml)组 A 值(0.76±0.020)、ECM+配套生长因子组(0.66±0.019)、ECM组(0.36±0.016)及第14天ECM+PRP(10ul/ml)组(0.90±0.052)、ECM+配套生长因子组(0.76±0.023)、ECM组(0.45±0.024)三组整体比较、两两比较均有差异(P<0.01)。粘附:ECM+PRP(10ul/ml)组(27.67±2.11)、ECM+配套生长因子组(27.37±1.30)与ECM组(18.67±1.45)(N=12)三组整体比较有统计学差异。ECM+PRP(10ul/ml)组、ECM+配套生长因子组各与ECM组两两比较均有统计学差异(P<0.01),ECM+PRP(10ul/ml)组、ECM+配套生长因子组之间两两比较无统计学差异。迁移:ECM+PRP(10ul/ml)组(22.13±0.93)、ECM+配套生长因子组(17.43±0.53)与 ECM 组(9.87±0.46)(N=12)三者比较,三者均有差异,ECM+PRP(10ul/ml)组(22.13±0.93)、ECM+配套生长因子组(17.43±0.53)均大于ECM组(9.87±0.46),其中以ECM+PRP(10ul/ml)组(22.13±0.93)迁移细胞数目最多。提示PRP能够使得EPC细胞迁徙能力明显提高。RT-PCR结果:在CD34表达中,四个实验组整体比较有统计学差异(P<0.01)。原代细胞组、ECM组与ECM+配套生长因子组三组整体比较有统计学差异(P<0.01)。ECM+PRP组与ECM+配套生长因子组两两比较有统计学差异(P<0.01),原代细胞组与ECM组两两比较无统计学差异。在CD45的表达中,四组整体比较有统计学差异(P<0.01)。原代细胞组、ECM组ECM+配套生长因子组三组整体比较有统计学差异(P<0.01),ECM+PRP组与ECM+配套生长因子组两两比较有统计学差异(P<0.01)。[结论]:统计分析结果提示:采用Aghaloo法获取的血小板浓聚物能够达到PRP的标准。PRP作为培养基生长因子替代品,其促进EPCs的增殖、迁移及分化的能力比配套生长因子强,而对EPCs粘附的影响两者效果无差异。PRP是EPCs体外培养中具有潜力的生长因子替代品。