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目的本实验通过Smad3特异性抑制剂(specific inhibitor of Smad3,SIS3)干预博来霉素诱导的肺纤维化大鼠,观察大鼠肺纤维化程度、转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、Smad3蛋白的表达情况。并通过观察内皮细胞表型,如血小板-内皮细胞粘附分子(Platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1/CD31);间质细胞表型,如α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle action,α-SMA)的表达情况,探讨TGF-β1/Smad3信号传导通路在博来霉素肺纤维化大鼠内皮间质转化(endothelial-mesenchymal transition,EndMT)中的作用。初步探讨SIS3是否具有减轻肺纤维化作用。方法选取96只,8-10周龄,体重(250±50g),健康,雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠,随机分成4组,每组24只。第一组:生理盐水对照组(NS组);第二组:博来霉素模型组(BLM组);第三组:SIS3干预组(SIS3组);第四组:二甲基亚砜溶媒组(DMSO组)。BLM组、SIS3组、DMSO组大鼠气管内注射博来霉素溶液(5mg/kg,0.3ml)建立肺纤维化动物模型;NS组大鼠以同样方法气管内注射等量生理盐水做对照。SIS3组大鼠造模同时腹腔内注射SIS3(2.5μg/g,1ml)做干预处理;BLM组大鼠造模同时腹腔内注射等量生理盐水做对照;DMSO组大鼠造模同时腹腔内注射等量DMSO做对照。4组大鼠分别在造模后第7天、14天、28天三个时间点随机处死8只,肺组织切片进行苏木素-伊红(HE)染色,观察4组大鼠肺组织结构和炎症反应;4组大鼠肺纤维化程度通过Masson染色、Ashcroft评分、肺组织羟脯氨酸(hydroxyproline,HYP)含量测定来观察;免疫组化检测各组TGF-β1、Smad3、内皮细胞表型(CD31)、间质细胞表型(α-SMA)表达情况,观察各组大鼠肺组织发生内皮间质转化(endothelial-mesenchymal transition,EndMT)程度,以及TGF-β1/Smad3信号传导通路在EndMT中的作用及机制。结果(1)HE染色:NS组:第7天、14天、28天肺泡结构均正常。BLM组:第7天、14天、28天可见充血、出血灶,胶原纤维渗出,病变范围逐渐增大,肺泡结构逐渐被被纤维组织填充,正常肺泡结构逐渐消失。SIS3组:第7天肺泡结构未被明显破坏,见少量充血、出血灶,少量炎性细胞浸润,肺泡间隔稍增厚;第14天、28天肺泡结构尚存,肺泡间隔增宽,炎症反应、纤维渗出均较BLM组大鼠减少,纤维化程度较轻。DMSO组:第7天、14天、28天肺组织病理学改变与BLM组大鼠相似。(2)Masson染色:NS组:第7天、14天、28天肺泡结构均正常,无明显蓝色胶原沉积。BLM组:第7天肺泡结构大致正常,肺泡腔内大量炎性细胞渗出,少量蓝色胶原沉积;第14天、28天肺泡结构破坏逐渐加重,肺泡间隔逐渐增厚,大量蓝色胶原填充,与NS组大鼠相比,蓝染胶原面积明显增加(P<0.05)。BLM组三个时间点Masson染色比较差异有意义(P<0.05)。SIS3组:第7天肺泡结构可见破坏,少量蓝染胶原沉积;第14天肺泡结构被大量破坏,蓝色胶原沉积面积相对第7天有所增加,肺泡结构依旧存在;第28天蓝色胶原沉积面积相对第14天仍有所增加,与NS组相比明显增加(P<0.05),但较BLM组明显减少(P<0.05)。SIS3组三个时间点Masson染色比较差异有意义(P<0.05)。DMSO组:第7天、14天、28天肺组织Masson染色与BLM组相似(P>0.05)。(3)HYP测定:NS组:第7天、14天、28天HYP含量相似(P>0.05)。BLM组:第7天、14天、28天肺组织HYP含量随着肺纤维化程度加重逐渐增加,与NS组比较明显增多(P<0.05);BLM组三个时间点HYP含量比较差异有意义(P<0.05)。SIS3组:第7天、14天、28天HYP含量随着肺纤维化程度加重逐渐增加,介于NS组与BLM组之间,较NS组增加(P<0.05),但较BLM组降低(P<0.05);SIS3组三个时间点HYP含量比较差异有意义(P<0.05)。DMSO组:HYP含量与BLM组相似,与BLM组相比差异无统计学意义(P>0.05)。(4)Ashcroft评分:NS组:第7天、14天、28天Ashcroft评分相似(P>0.05);BLM组:第7天较NS组有所增加,第14天、28天Ashcroft评分显著增加,与NS组相比差异有意义(P<0.05);BLM组三个时间点Ashcroft评分比较差异有意义(P<0.05);SIS3组:Ashcroft评分分值则介于NS组与BLM组之间,较NS组增加(P<0.05),较BLM组明显降低(P<0.05);SIS3组三个时间点Ashcroft评分比较差异有意义(P<0.05);DMSO组:Ashcroft评分与BLM组相似,与BLM组相比差异无统计学意义(P>0.05)。(5)TGF-β1、Smad3免疫组化:NS组:第7天、14天、28天肺泡结构均正常,可见TGF-β1、Smad3弱阳性棕黄色表达区域;BLM组:第7天、14天、28天纤维化程度逐渐加重,可见肺组织TGF-β1、Smad3阳性表达区域逐渐增大,与NS组相比差异有意义(P<0.05);BLM组三个时间点TGF-β1、Smad3阳性表达区域比较差异有意义(P<0.05);SIS3组:TGF-β1、Smad3阳性表达趋势与BLM组相似,较NS组增加,但较BLM组少,差异有意义(P<0.05);SIS3组三个时间点TGF-β1、Smad3阳性表达区域比较差异有意义(P<0.05);DMSO组:TGF-β1、Smad3阳性表达区域与BLM组相似,差异无统计学意义(P>0.05)。(6)CD31免疫组化:NS组:第7天、14天、28天肺血管管壁无增厚,肺血管内皮可见CD31阳性表达;BLM组:第7天肺血管壁稍增厚,仍可见CD31棕黄色阳性表达区域;第14天、28天肺血管壁逐渐增厚,肺血管畸形,CD31阳性表达区域明显减少,与NS组比较差异有意义(P<0.05);BLM组三个时间点CD31阳性表达区域比较差异有意义(P<0.05);SIS3组:CD31阳性表达趋势与BLM组相似,小于NS组,大于BLM组,差异具有统计学意义(P<0.05);SIS3组三个时间点CD31表达阳性区域比较差异有意义(P<0.05);DMSO组:CD31阳性表达区域与BLM组相似,差异无意义(P>0.05)。(7)α-SMA免疫组化:NS组:第7天、14天、28天肺血管形态正常,可见α-SMA极微弱阳性表达;BLM组:第7天肺血管壁稍增厚,可见少量α-SMA表达;第14天、28天血管壁逐渐增厚、畸形,α-SMA阳性表达区域明显增加,与NS组比较差异具有统计学意义(P<0.05);BLM组三个时间点α-SMA阳性表达区域比较差异有意义(P<0.05);SIS3组:α-SMA表达趋势与BLM组相似,多于NS组,少于BLM组,差异具有统计学意义(P<0.05);SIS3组三个时间点α-SMA阳性表达区域比较差异有意义(P<0.05);DMSO组:α-SMA阳性表达与BLM组相似,差异无统意义(P>0.05)。结论(1)EndMT参与肺纤维化的形成。(2)TGF-β1/Smad3信号通路在EndMT中可能起到重要作用。(3)SIS3通过特异性抑制Smad3蛋白的表达,抑制EndMT过程,从而减轻肺纤维化。