微孢子虫（Protozoan:Microsporidia）是一类细胞内专性寄生的单细胞真核生物,广泛寄生于无脊椎动物和脊椎动物,包括人类;是经济昆虫、鱼类、兔类、产毛动物、啮齿类及灵长类的常见病原。自19世纪发现家蚕微孢子虫以来,不断有新的种类被分离鉴定,目前已发现有超过150个属1200多种。自1959年发现了微孢子虫感染免疫缺陷型病人后,相继发现8个属14个种感染人类,尤其是艾滋病病人。由于微孢子虫与人类的健康密切相关,因此引起了科学界的广泛关注。家蚕微孢子虫是微孢子属的典型种,普遍寄生于家蚕而引发家蚕微粒子病导致毁灭性病害,攻克微粒子病这一顽症,是蚕业界研究领域的重点和难点,但目前国内外有关家蚕微孢子虫的分子生物学研究极为薄弱,缺乏对家蚕微孢子虫的深刻认识。本实验室近期完成了家蚕微孢子虫全基因组测序及其框架图的绘制,为研究家蚕微孢子虫提供了重要的数据和信息基础。我们通过全基因组序列的生物信息分析,鉴定得到一些丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine protease inhibitor,Serpin）基因。而在其他微孢子虫如兔脑原虫微孢子虫、蝗虫微孢子虫、蜜蜂微孢子虫基因组中都没有发现serpin基因的存在。对家蚕微孢子虫而言,serpin的研究无疑是一个崭新的课题。本研究旨在鉴定家蚕微孢子虫serpin基因,研究其功能和作用靶标,为阐明微孢子虫的侵染机制以及家蚕微孢子虫与宿主的相互作用奠定基础。丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin在蛋白酶介导的一系列生命进程中起着重要的调控作用。在长期的进化过程中,病原生物采用了一系列特异的策略来逃避宿主的防御体系。鉴于serpin在生命进程的调节能力,家蚕微孢子虫有可能利用自身编码的serpin基因来抵御宿主家蚕的防御系统。家蚕在内的大多数鳞翅目昆虫消化道内pH为中性到碱性,主要含有丝氨酸蛋白酶,在生长发育中起着重要作用。家蚕微孢子虫被家蚕吞食后,沿着消化道入侵小肠上皮细胞,在这入侵过程中,微孢子虫处于一个宿主蛋白酶含量丰富的环境中,这将对微孢子虫的生存和繁殖产生极为不利的影响。为了确保自身的生存,微孢子虫有可能分泌出serpin蛋白,与家蚕中肠内的丝氨酸蛋白酶作用形成酶一抑制剂复合物,抑制蛋白水解酶的活性,干扰其免疫系统,同时扰乱昆虫的正常代谢,最终导致昆虫发育不正常甚至死亡。本研究首先利用生物信息学分析,结合家蚕微孢子虫的全基因组数据鉴定分析家蚕微孢子虫serpin基因,然后进行体外分子克隆、原核表达,对其编码的蛋白进行免疫电镜表达定位分析,采用GST-pull down和质谱技术分离鉴定出serpin蛋白的靶蛋白,并对它们的蛋白酶抑制活性功能进行了研究。主要研究结果如下:1.家蚕微孢子虫serpin基因的鉴定与生物信息学分析以家蚕微孢子虫全基因组序列为基础,通过比较基因组学分析,对家蚕微孢子虫serpin基因进行了鉴定。将MEROPS的蛋白酶及抑制剂数据库及PFAM、GenBank的serpin氨基酸序列,与家蚕微孢子虫基因组序列作BLASTP比对检索,共鉴定出了11个serpin候选基因。在已报道另外三种微孢子虫（兔脑炎微孢子虫、蝗虫微孢子虫、蜜蜂微孢子虫）的基因组数据库中,却都没有发现serpin的同源基因,因此家蚕微孢子虫serpin基因是家蚕微孢子虫的物种特有序列。在候选的家蚕微孢子虫11个serpin中,有6个蛋白（NBO₁8g0004、NBO₁8g0021、NBO₃4g0030、NBO₄2g0004、NBO₃72g0002、NBO₁570g0002）为分泌型蛋白,这些蛋白有可能被分泌至胞外,参与家蚕微孢子虫与宿主家蚕的互作。多重序列比对结果表明,家蚕微孢子虫serpin氨基酸序列与其他物种的serpin相似性较低,但仍具有典型的serpin基因特征,其中包括保守的hinge区。由于家蚕微孢子虫序列变异程度较大,仅仅根据氨基酸序列的保守性分析,还不能确定这些serpin基因是否具有抑制活性。系统进化结果表明,家蚕微孢子虫serpin基因没有与已知的16个进化枝聚在一起,而是单独聚为一类,在系统树上成为相对独立的一枝,它们可能属于一个新的进化枝。所有的家蚕微孢子虫serpin基因聚为一类,在氨基酸水平表现较高的相似性,说明它们可能是基因复制的产物。2.家蚕微孢子虫serpin基因家族的进化本章通过系统发生分析、统计学分析等方法,对家蚕微孢子虫11个serpin的起源、扩增和功能分化进行了分析讨论。分析表明,从目前的数据信息来看,家蚕微孢子虫serpin基因水平转移而来的可能性很低,很可能是从头起源的。从serpin基因的数目可以看出,家蚕微孢子虫serpin基因发生了扩增,共分为6个家族,在分布上有成簇和散在分布现象。serpin基因拷贝与片段重复及转座元件的相关性分析表明,在家蚕微孢子虫11个serpin中,有6个基因与转座元件存在极显著相关性,有两对基因是片段重复产生的多拷贝。氨基酸序列比对分析发现,家蚕微孢子虫serpin基因存在功能上的分化。氨基酸替换率分析表明家蚕微孢子虫serpin受到负向选择,这说明目前serpin基因的功能处于稳定状态,也即表明家蚕微孢子虫的serpin基因的功能分化已趋于稳定。3.家蚕微孢子虫serpin基因的克隆和表达本研究在家蚕微孢子虫基因组数据的基础上,通过RT-PCR、分子克隆、原核表达以及Western印迹检测方法,成功鉴定了两个家蚕微孢子虫候选serpin基因Nbspn106和Nbspn286。RT-PCR表明,serpin基因Nbspn106和Nbspn286在感染后的第一天即可检测到转录活性,随后各个感染时期均有转录表达活性,说明它们可能在侵染过程中起着重要作用。分别构建原核重组载体pGEX4T-1-Nbspn106和pGEX4T-1-Nbspn286,然后在大肠杆菌中诱导表达。经IPTG诱导表达后收集菌体,超声裂解后,将上清液经GSTrapFF亲和层析柱纯化,亲和纯化得到纯的GST-NbSPN融合蛋白,为serpin蛋白的功能研究做准备。同时将纯化的表达产物免疫小鼠,制备抗血清,并进行Western blot分析,在家蚕微孢子虫总蛋白中检测到了特异的、分子量大小与预测基本一致的蛋白质条带。试验结果表明所制备的抗血清可以用于serpin蛋白NbSPN106、NbSPN286的进一步体内表达定位研究。4.家蚕微孢子虫serpin蛋白的定位研究为了确定serpin蛋白表达的特异性和亚细胞定位特点,采用免疫胶体金标记的方法,利用抗serpin蛋白NbSPN106、NbSPN286的抗血清,对感染家蚕微孢子虫的5龄3天的家蚕丝腺组织进行低温包埋后样品处理。电镜观察结果显示在孢子胞原质以及家蚕丝腺的组织间隙中,有比较多的胶体金颗粒零散分布,说明serpin蛋白NbSPN106、NbSPN286是分泌型蛋白,它们在微孢子虫体内合成,然后被分泌到宿主家蚕的组织间隙中发挥作用。同时,用抗小鼠阴性血清作为对照,进行免疫电镜分析,在孢子细胞和宿主组织空间都没有发现到胶体金颗粒的存在。比较对照试验的胶体金定位分析结果,说明了针对NbSPN106、NbSPN286的抗血清是特异性较强的抗体,也证实了serpin蛋白NbSPN106、NbSPN286是孢子特异表达的分泌性蛋白,它们在微孢子虫体内合成,然后被分泌到胞外,可能参与家蚕微孢子虫与宿主家蚕的互作。5.家蚕微孢子虫serpin蛋白的功能探索本研究利用Native-PAGE和活性染色对serpin蛋白NbSPN106、NbSPN286的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶抑制活性做了初步的探索。利用亲和层析柱得到纯化的外源重组表达蛋白,先用凝血酶切除GST标签,然后经Native-PAGE电泳后,凝胶中的serpin蛋白抑制活性以Uriel和Berges的方法进行活性染色。试验表明,利用原核表达的serpin蛋白NbSPN106、NbSPN286没有检测到胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶抑制活性。其原因可能是:（1）家蚕微孢子虫分泌的serpin蛋白NbSPN106、NbSPN286虽然具有信号肽,但其功能可能不是抑制蛋白酶的活性,它们有可能执行其他生理功能:（2）因为原核细胞内缺少一些维持蛋白正确构象的功能蛋白,如分子伴侣和一些与糖基化、乙酰化以及二硫键形成有关的蛋白,所以通过原核表达的serpin蛋白没有活性或者活性很低;（3）serpin蛋白NbSPN106、NbSPN286的作用底物非常专一,商品化的牛胰蛋白酶和牛胰凝乳蛋白酶不是其作用底物,因此活性不会被抑制。家蚕微孢子虫分泌的serpin蛋白NbSPN106、NbSPN286的生理功能还需要进一步的试验验证。6.家蚕微孢子虫serpin蛋白的靶蛋白鉴定为进一步了解serpin蛋白的功能,利用GST-pull down技术寻找与serpin蛋白NbSPN106、NbSPN286相互作用的靶蛋白。将重组表达的GST融合蛋白NbSPN106、NbSPN286先与谷胱甘肽琼脂糖小珠结合,充当诱饵蛋白,再与感染了家蚕微孢子虫的家蚕中肠总蛋白混合孵育,通过蛋白质间的相互作用,捕获目标蛋白,然后洗脱进行SDS-PAGE分析,结果分别检测到了3条可能的互作蛋白质条带。将可能的互作蛋白质条带采用LC-MS/MS质谱分析,检索到了4个可能与家蚕微孢子虫serpin蛋白有互作关系的家蚕蛋白质,其中3个蛋白（BGIBMGA006647-PA、BGIBMGA004329-PA、BGIBMGA006299-PA）在NbSPN106、NbSPN286的互作条带中都出现。4个靶蛋白BGIBMGA006647-PA、BGIBMGA004329-PA、Contigjp₁689、BGIBMGA006299-PA分别注释为SH3BP5、VtaA1、核酸内切酶和反转录酶类似蛋白、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。这些蛋白主要功能是参与信号转导。但是,经GST沉淀试验-质谱分析得到的4种家蚕蛋白质是否真正与家蚕微孢子虫serpin蛋白相互作用,还需要进一步的试验证明。