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目的:淋巴瘤是血液系统常见的恶性肿瘤之一,研究发现在淋巴瘤细胞中存在全体基因组的低甲基化和局部CpG岛异常高甲基化,已经发现很多基因的启动子高甲基化与淋巴瘤相关,这些基因参与很多的已知的细胞信号传导通路,如降钙素,控制细胞生长的调节因子p15, p16,及已经被人们所认知的抑癌因子ARF,BLU。这些基因与细胞的生长,增殖,分化,胚胎发育及机体免疫等生物学功能等密切相关。PTPRO(受体型酪氨酸磷酸酶)是新发现的PTP成员之一,是JAK-STAT信号传导途径的负调控因子之一,在调控细胞生长,增殖,分化,胚胎发育及免疫等生物学功能方面发挥重要的作用是一个潜在的抑癌因子。其截短型PTPROt仅限于造血细胞的表达,特别是淋巴细胞,通过表达谱芯片及组织微阵列技术证实该基因在恶性淋巴瘤细胞系及某些白血病细胞系中表达明显下降,该基因的沉默可导致相关信号转导分子活性增强从而促进肿瘤细胞的恶性增殖。本实验以淋巴瘤病人的淋巴结组织以及淋巴瘤细胞株为研究对象,旨在研究PTPROt在淋巴瘤病人和炎性及反应性增生的病人中的表达情况及其各自的甲基化状态,同时对淋巴瘤细胞株应用不同浓度的去甲基化药物干预不同的时间后,比较PTPROt mRNA的表达情况和甲基化状态的改变以及细胞株的增殖和凋亡情况。方法:1收集病理诊断明确未经治疗的淋巴瘤及炎性和反应性增生病人的淋巴结组织,以炎性和反应性增生病人作为对照组,用半定量和荧光实时定量PCR的方法分别检测PTPROt基因在淋巴瘤病人组和炎性及反应性增生病人的表达情况。2培养细胞株,人淋巴瘤细胞株Raji和Jurkat,分别培养于含10%灭活小牛血清(FBS)、100U/ml的青霉素和100μg/ml硫酸链霉素的RPMI1640培养液中,置37℃、体积分数为5%的二氧化碳的培养箱中培养,每2-3天传代1次,实验使用对数生长期的细胞。当细胞生长达到一定数量时应用不同浓度的去甲基化药物5-杂氮-2′-脱氧胞苷对其处理,在不同的时段收取细胞检测其PTPROt基因的表达水平。3从淋巴结组织中及药物干预后的淋巴瘤细胞株中提取DNA进行甲基化PCR(MSP),检测淋巴瘤病人组,炎性和反应性增生病人组及淋巴瘤细胞株中PTPROt基因的甲基化状态。4调整细胞密度为5.0×105/ml,接种于96孔无菌培养板中,每孔200μl,在Raji中加入5-杂氮-2′-脱氧胞苷终浓度分别为1.0μmol/L,5.0μmol/L,10.0μmol/L.在Jurkat中加入5-杂氮-2′-脱氧胞苷终浓度分别为1.0μmol/L,3.0μmol/L,5.0μmol/L.均设不加药孔和空白对照孔,每组另设两个复孔。分别作用24h,48h,72h三个不同的时间,用二苯基溴化四氮唑蓝法(MTT)检测细胞经药物干预后的增殖情况。5调整细胞密度为5.0×105/ml,接种于6孔无菌培养板中,应用不同浓度的5-杂氮-2′-脱氧胞苷分别作用于Raji和Jurkat细胞,分别作用24h,48h,72h三个不同的时间收集细胞采用AnnexinV/PI法测定细胞凋亡,检测细胞凋亡的情况。结果:1应用半定量PCR检测淋巴瘤病人和炎性及反应性增生的病人,在读胶仪下发现炎性及反应性增生的病人在213bp处存在明显的扩增条带,而淋巴瘤病人标本中则缺失或相对较弱,荧光实时定量进一步检测PTPROt mRNA的表达水平,在对照组即炎性和反应性增生的病人和淋巴瘤病人的淋巴结组织中PTPROt mRNA表达水平分别为1.174±0.586,0.557±0.340( P=0.01<0.05 ),具有统计学意义。2在Raji细胞株中以1.0μmol/L,5.0μmol/L,10.0μmol/L药物5-杂氮-2′-脱氧胞苷作用24h,48h,72h后基因表达分别1.03±0.02,1.103±0.051,1.263±0.064 ,( P=0.009<0.05 ) 1.027±0.022 , 1.203±0.064 , 1.41±0.113(P=0.014<0.05),1.07±0.02,1.36±0.107,1.54±0.04(P=0.02<0.05),在Jurkat细胞株中以1.0μmol/L,3.0μmol/L,5.0μmol/L的去甲基化药物5-杂氮-2′-脱氧胞苷作用不同的时间即24h,48h,72h后基因表达分别1.08±0.152,1.246±0.057,1.263±0.064(P=0.03<0.05)1.306±0.03,1.633±0.182,1.773±0.064(P=0.042<0.05),1.478±0.112,1.923±0.68,2.066±0.208 (P=0.01<0.05),PTPROt基因表达存在显著差异并随着浓度的增高PTPROtmRNA的表达水平也升高。3在23例淋巴瘤患者中16例PTPROt基因启动子存在甲基化,可见甲基化产物的条带,而14例炎性和反应性增生的病人启动子不存在甲基化,可见非甲基化的条带。在细胞株Raji和Jurkat中存在甲基化条带,经去甲基化药物5-杂氮-2′-脱氧胞苷干预后,细胞株的甲基化状态减弱或消失。4应用5-杂氮-2′-脱氧胞苷后淋巴瘤细胞株的增殖受到抑制,随着去甲基化药物5-杂氮-2′-脱氧胞苷浓度的增加和药物作用时间的延长细胞的抑制率相应增加,呈现出一定的趋势。5去甲基化药物可以促进淋巴瘤细胞株的凋亡,应用随着剂量的增加和时间的延长细胞的凋亡率增加。结论:在淋巴瘤细胞中PTPROt mRNA的表达减弱或消失,其机制是淋巴瘤细胞中PTPROt基因的启动子存在过甲基化,5-杂氮-2′-脱氧胞苷可使淋巴瘤细胞株Raji和Jurkat细胞的PTPROt基因启动子去甲基化PTPROt mRNA重新表达,应用不同浓度的5-杂氮-2′-脱氧胞苷作用不同的时间基因的表达存在显著差异,并随着药物浓度的加大和作用时间的延长基因表达增强,同时甲基化状态减弱或消失,肿瘤细胞增殖受到抑制,凋亡率增加。PTPROt很可能是JAK/STAT通路中一个重要的抑制因子,通过抑制JAK/STAT通路发挥抑制淋巴瘤细胞生长的作用。