基于氧化石墨烯的microRNA荧光传感器研究

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MicroRNA(miRNA)是一类长约19至25个核苷酸的非编码小分子RNA,它在个体生物发育分化等生命活动中有着重要调节作用,并且miRNA的表达与癌症等重大疾病的发病密切相关,因此实现miRNA的灵敏检测具有重要的意义。有研究表明,氧化石墨烯(GO)能够高效猝灭多种染料的荧光,并且具有优良的生物相容性、高吸附能力等优点,因此将GO作为荧光的猝灭基团,构建基于GO与染料(或染料标记的生物分子)之间的能量共振转移体系,已经成为荧光生物传感器领域的研究热点。本论文以荧光素(FAM)标记的单链DNA(FAM-DNA)作为核酸探针,加入GO后,由于FAM-DNA探针与GO之间存在较强的π-π堆积效应,因此FAM-DNA探针会迅速的吸附到GO的表面,FAM-DNA探针的荧光素基团与GO发生能量共振转移,导致FAM-DNA探针的荧光信号被完全猝灭;然而,加入目标分子miRNA时,FAM-DNA探针和目标分子通过碱基配对原则杂交形成稳定的双链结构,当GO存在时,由于双链核酸分子自身的双螺旋刚性结构,其与GO的结合能力显著降低,不会被吸附在GO表面,从而可保持其荧光信号。荧光信号的强弱与体系中miRNA的浓度成正比,从而实现了miRNA的定量检测。在此基础上,我们利用酶切放大机制来进一步提高该方法对miRNA检测的灵敏度。我们引入一种特异性双链核酸酶(DSN),DSN能够特异性切割完全匹配的DNA双链或者RNA与DNA完全匹配杂交双链中的DNA,对单链的DNA或者RNA无任何作用。在上述实验原理基础上,当目标分子miRNA与FAM-DNA探针杂交形成稳定的双链结构时,加入DSN酶,DSN酶切割杂交双链结构中的FAM-DNA探针,切碎后的荧光基团不能被GO吸附,同时目标分子miRNA被释放出来,再次与其它的FAM-DNA探针杂交,DSN酶再切割FAM-DNA探针,如此循环反复进行,实现了一个目标分子与多个FAM-DNA探针循环杂交、切割,大量的荧光基团被释放出来,体系的荧光信号被显著放大,通过检测体系荧光信号的变化,实现了对miRNA的高灵敏度检测。该方法实验原理简单,背景干扰小,操作快速简单,可检测到低至60pM的目标分子miRNA。
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