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背景:化疗是大多数肿瘤病人术后或者姑息治疗的主要手段,尤其是像胃癌这样缺乏有效靶向药物的肿瘤。迄今为止,化疗耐药仍然是肿瘤治疗失败的主要原因之一。葡萄糖代谢重编程是肿瘤化疗耐药的重要机制,我们前期的研究表明糖酵解在胃癌耐药细胞株中明显增强,然而关于糖酵解在肿瘤耐药细胞中的激活及其影响肿瘤耐药的机制目前尚不完全清楚。丙酮酸脱氢酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinase,PDK)是线粒体中决定丙酮酸命运的关键酶,通过负性调控丙酮酸脱氢酶复合体抑制丙酮酸进入三羧酸循环而促进肿瘤细胞糖酵解。我们通过表达谱芯片筛选发现胃癌耐药细胞中PDK3显著上调,但目前PDK3在胃癌耐药肿瘤细胞中高表达的机制和作用尚未见相关报道。目的:明确PDK3在胃癌耐药细胞糖酵解激活中的作用及其对胃癌化疗耐药的影响,并深入探索PDK3在胃癌化疗耐药中的表达调控机制。方法:运用气相飞行时间质谱(GC-TOF/MS)分析研究敏感细胞SGC7901、耐药细胞SGC-R、PDK3及热休克因子 1(Heat shock factor 1,HSF1)高表达的SGC7901 细胞中的葡萄糖代谢谱变化,并采用比色法进行验证。基因富集分析(GSEA,Gene Set Enrichment Analysis)研究糖酵解相关酶类基因在耐药细胞中的富集情况。通过MTS、流式细胞仪、Western Blot及裸鼠成瘤等实验方法检测基因表达改变或者使用抑制剂后胃癌细胞体内外化疗敏感性变化。通过荧光素酶报告基因及染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)等实验方法检测 HSF1 对PDK3 的转录调控,利用免疫共沉淀(Immunoprecipitation,IP)、荧光共聚焦及GST-pull down等实验探索PDK3调控HSF1的分子机制。结果:代谢谱分析发现胃癌耐药细胞中糖酵解相关代谢产物明显增加,G S EA分析发现胃癌耐药细胞中糖酵解相关基因表达明显上调,PDK3是其中表达上调最高的基因。耐药细胞中siRNA敲低PDK3表达或者DCA抑制PDK3活性可以明显增强PDH活性,下调糖酵解,并逆转胃癌化疗耐药;而在敏感细胞中高表达PDK3后可以上调糖酵解促进化疗耐药。与敏感细胞相比,PDK3在耐药细胞中mRNA和蛋白均明显增加,生物信息学分析发现PDK3很可能是转录因子HSF1的直接靶基因,提示耐药细胞中HSF1可能通过转录调控PDK3表达。我们的确发现,HSF1在耐药细胞中蛋白表达明显增加,HSF1可以结合到PDK3启动子区,敲低HSF1表达后PDK3 mRNA水平明显下调,并且HSF1可以通过PDK3抑制耐药细胞中PDH的活性。有趣的是除了在线粒体中抑制PDH促进糖酵解外,PDK3还可以穿梭入核与HSF1蛋白发生结合。GST-pull down检测发现HSF1的226-315氨基酸序列是与PDK3结合的主要区域,磷酸激酶GSK3β和ERK1分别催化的303和307位丝氨酸刚好处在这一区域,而HSF1(303+307)位点磷酸化是泛素E3链接酶FBXW7诱导HSF1泛素化降解所必须的。我们发现PDK3通过与该区域结合竞争性的抑制了 GSK3β对HSF1的磷酸化,导致HSF1(303+307)位点磷酸化水平下降,从而抑制FBXW7所诱导的HSF1蛋白泛素化降解。此外,HSF1高表达的细胞与耐药细胞SGC-R以及PDK3高表达的细胞均表现出相似的糖酵解激活表型,与PDK3一致的是,基因敲除及HSF1化学抑制剂在体内外亦可以有效的逆转胃癌化疗耐药。结论:HSF1通过转录调控促进PDK3在胃癌耐药细胞中的表达,而PDK3除了参与激活糖酵解外,同时可以穿梭入核与HSF1蛋白结合竞争性抑制GSK3β依赖的HSF1磷酸化,从而抑制FBXW7介导的HSF1蛋白泛素化降解。因此,PDK3与HSF1形成正反馈环促进胃癌细胞糖酵解增强并最终导致胃癌化疗耐药,干扰PDK3与HSF1正反馈环可能成为逆转胃癌化疗耐药的新靶点。