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亨廷顿病（Huntington’s disease，HD）是一种家族遗传性神经退行性疾病，临床上，以运动障碍、精神异常和痴呆为特点；病理学上，以纹状体和大脑皮质神经元选择性死亡为特征。HD由亨廷顿基因第一外显子中的CAG三核苷酸序列过度重复（>35）编码突变亨廷顿蛋白（mutant huntingtin，mHtt）所致。正常Htt主要表达、定位于神经元细胞质内，与细胞内的膜结构和许多细胞器如线粒体、高尔基体、内质网、内吞小体、自噬囊泡的功能密切相关。mHtt在神经元胞质和核内形成不溶性聚集物，且聚集物的数量随着年龄的增长逐渐增多。mHtt可通过影响基因表达、线粒体功能、细胞内运输、新陈代谢产生毒性作用。突触作为神经元特有的结构容易受到毒性蛋白的损害，突触功能障碍常见于多种神经退行性疾病中。尽管许多研究已经对HD中突触功能障碍有一定的探索，但mHtt是否以及如何直接导致HD的神经功能障碍的机制目前尚不明确，其对于神经细胞突触功能的影响也有待进一步研究。正因为神经元具有特有的突触结构，所以探讨突触mHtt是否可以导致年龄相关性的HD神经症状和早期死亡，以及突触mHtt是否直接引起突触神经递质释放功能的障碍，对区分mHtt对各个亚细胞区的功能影响至关重要。本实验通过构建表达突触小体相关蛋白（synaptosomal-associated protein25，SNAP25）与Htt融合蛋白（SNAP25-Htt20Q/150Q）的质粒，制备一种将mHtt选择性地靶向定位在突触前细胞质中的新型HD转基因小鼠模型：SNAP25-Htt150Q小鼠和相应的SNAP25-Htt20Q对照小鼠，并应用这种新的HD转基因小鼠模型对突触mHtt的毒性及其相关机制进行研究，以期揭示突触mHtt在HD的致病机理中的作用。1.突触Htt在SNAP25-Htt转基因小鼠神经元突触中选择性表达采用小鼠胚胎原核注射方法建立转基因小鼠模型，挑选出可以稳定繁殖、转基因表达位置及表达量明确的SNAP25-Htt20Q/150Q品系。比较SNAP25-Htt20Q/150Q转基因小鼠品系转基因mHtt表达水平结果表明，SNAP25-Htt150Q表达水平低于SNAP25-Htt20Q中的表达水平。同时，与利用小鼠内源性亨廷顿基因启动子表达HttCAG150的基因敲入(knock in，KI)小鼠[1]相比，SNAP25-Htt150Q mHtt表达水平低于Htt CAG150全长mHtt内源性表达水平。亚细胞器差速离心方法可以富集突触蛋白，用此方法提取SNAP25-Htt20Q/150Q转基因小鼠大脑皮质突触蛋白结果显示，两种融合蛋白都富集在突触前组分，并且该组分中也发现了Htt的降解片段。用抗Htt抗体(mEM48)对SNAP25-Htt150Q转基因小鼠脑片进行免疫组织化学染色表明，SNAP25-Htt150Q在大脑皮质和纹状体中形成细胞核外神经毡聚集物。电子显微镜(EM)结果也进一步证实mHtt聚集物存在于轴突和突触前细胞质中，而不存在于突触后细胞质和突触前膜。Western Blot和免疫荧光双标结果显示，SNAP25-Htt150Q在神经突起中形成聚集物，而大多数Htt的聚集物不能被SNAP25抗体所标记，表明SNAP25-Htt150Q的蛋白质水解可能会导致mHtt片段缺失SNAP25表位并更容易聚集。尽管SNAP25靶向性地将mHtt定位在突触前，但可能有部分SNAP25-Htt150Q由于蛋白质水解作用导致融合蛋白发生断裂。通过亚细胞器分离、免疫荧光染色和电子显微镜的手段，充分证明了mHtt转基因产物选择性地表达在转基因小鼠的突触前细胞质，并且主要由切割后的不含有SNAP25的mHtt片段形成聚集物。因此，本课题成功构建了将mHtt特异性表达在突触前细胞质中的一种新型HD小鼠模型。2．SNAP25-Htt150Q转基因小鼠HD症状随年龄进行性加重为了判断SNAP25-Htt150Q小鼠是否出现类似于大多数HD转基因小鼠模型的症状，对SNAP25-Htt转基因小鼠进行了行为学检测，发现老龄SNAP25-Htt150Q转基因小鼠出现典型的HD表型，如：体重减轻、抱屈反射和弓背外观。该表型呈年龄相关性地渐进性发展。SNAP25-Htt150Q转基因小鼠早于野生型和SNAP25-Htt20Q转基因小鼠死亡。旋转杆实验、声学刺激、明暗穿箱实验及平衡木行走实验均表明突触mHtt能导致小鼠出现进行性的运动能力下降。3．突触mHtt引起神经病理学损害并抑制神经递质释放对小鼠脑片进行星形胶质细胞标记蛋白胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体染色，发现SNAP25-Htt150Q转基因小鼠皮质、纹状体和小脑各脑区GFAP染色明显增强，提示突触mHtt引起神经元损伤后反应性的神经胶质细胞增生。对GFAP的Western Blot检测也证实SNAP25-Htt150Q小鼠纹状体中星形胶质细胞明显增生。应用电生理方法检测突触mHtt对突触电活动功能的影响发现，SNAP25-Htt150Q小鼠大脑切片的感觉运动皮质中成对脉冲刺激的振幅(PPF)及长时程增强(LTP)的信号强度明显降低；分离出SNAP25-Htt转基因小鼠的皮质纹状体脑片检测[3H]谷氨酸释放，结果表明SNAP25-Htt150Q脑片谷氨酸释放减少，而[3H]GABA释放并未受到影响，由此表明谷氨酸囊泡释放更容易受到突触mHtt损伤；采用PC12-Htt-exon1-20Q/150稳转细胞系评估突变mHtt是否影响囊泡释放发现，PC12稳转细胞系中[3H]多巴胺释放的测定结果显示mHtt能抑制PC12细胞神经递质多巴胺的释放。4．突触mHtt与突触素I的C端相互作用增强突触mHtt是选择性地定位在突触前细胞质，可与突触囊泡异常结合导致突触信号传递障碍。从野生型（wild type，WT）小鼠脑皮质中分离出突触小体蛋白，分别与PC12-Htt-exon1-20Q/150Q稳转细胞系来源的蛋白样品孵育后进行检测，发现相比于PC12-Htt-exon1-20Q，突触小体更容易与PC12-Htt-exon1-150Q结合。为了探索mHtt与突触蛋白的相互作用，用mEM48抗体对SNAP25-Htt转基因小鼠脑皮质突触蛋白进行免疫沉淀，并对沉淀得到的蛋白进行质谱分析，发现了578种蛋白质和1732种多肽，并证实SNAP25-Htt150Q可以沉淀更多的突触素I蛋白。应用SNAP25-Htt转基因小鼠、Htt CAG150KI小鼠脑组织及PC12-Htt-exon1-20Q/150Q稳转细胞系模型，经免疫共沉淀实验显示mHtt相比于正常Htt与突触素I相互作用更强。突触素I有1a和1b两个亚型，在其各个结构域上含有大量的磷酸化位点，而其C端具有脯氨酸富集结构域这一特殊片段。用删除C端脯氨酸富集结构域的片段化突触素I (tsynapsin)与Htt-exon1-20Q/150Q共转染HEK293细胞后，免疫共沉淀分析显示，尽管突触素Ia和突触素Ib都与mHtt相互作用，但去除脯氨酸富集结构域后则消除了突触素I与mHtt的结合关系。5．mHtt通过突触素I脯氨酸富集区的相互作用抑制突触素I磷酸化突触素I参与囊泡锚定、融合、并从突触前膜释放神经递质中的功能，这一过程与突触素I的磷酸化水平直接相关。在HEK293细胞中表达不同片段长度的突触素I，检测mHtt是否影响突触素I的磷酸化水平。比较全长突触素Ib和截断C端的突触素I(tsynapsin) N端9号位点丝氨酸的磷酸化水平显示，Htt-150Q抑制突触素Ib中9号位点丝氨酸磷酸化水平，而与Htt-20/150Q共转染的tsynapsin中9号位点丝氨酸磷酸化水平无明显差异。因此，mHtt对突触素I磷酸化的抑制依赖于mHtt与突触素I的C端脯氨酸富集区结构域的相互作用。对PC12-Htt稳转细胞系和SNAP25-Htt转基因小鼠脑蛋白进行Western Blot分析，检测突触素I不同位点的磷酸化抗体水平，结果显示，PC12-Htt-exon1-150Q细胞及SNAP25-Htt150Q转基因小鼠脑皮质中内源性突触素I的S9、S549和S603位点的磷酸化水平均明显降低。以上研究表明，mHtt在突触前可通过与突触素I蛋白C端区域的异常相互作用使多个位点的磷酸化降低，从而抑制突触神经递质释放，导致神经病理学损害与相应神经症状，为探索治疗HD的方法提供了新的靶点。