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目的:日本血吸虫感染宿主引起的主要病理变化是肝脏纤维化,由于血吸虫虫卵在机体的肝脏中沉积形成虫卵肉芽肿,最终导致宿主肝脏发生纤维化,肝星状细胞是纤维化发生过程中起关键作用的细胞。TOPK是一种已发现的新的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶,属于MAPKK分子蛋白家族。TOPK在多种生物学过程如肿瘤的发生发展、恶性转化、细胞周期、细胞增殖和凋亡等都有参与调控的作用。TOPK在血吸虫感染中的作用以及对血吸虫感染引起的星状细胞活化的影响尚未见相关报道,本文主要研究TOPK激酶对小鼠感染日本血吸虫后肝星状细胞活化和肝纤维化的影响及其机制。方法:雌性8周龄BALB/C小鼠用戊巴比妥钠或者水合氯醛麻醉,经腹部皮肤拔毛,粘附法感染日本血吸虫尾蚴25±1条/只。感染4周后经尾静脉注射TOPK抑制剂HI-TOPK-032,对照组给予DMSO,每3天注射一次,持续两周后处死小鼠。取小鼠肝组织,制成石蜡切片后Masson染色法观察肝脏胶原沉积面积,Western blot检测肝组织α-SMA和Col1a1。从正常小鼠和血吸虫感染小鼠中分别分离出肝组织和原代肝星状细胞,提取总蛋白,Western blot检测TOPK表达,同时肝组织制成组织切片免疫荧光染色法观察TOPK的表达。体外培养的肝星状细胞系LX-2用不同浓度(1、2、4μM)的HI-TOPK-032处理12、24、36和48h后CCK8法检测LX-2的细胞活性。LX-2细胞用2μM HI-TOPK-032在体外处理36 h后,FCM检测LX-2的增殖和凋亡,Real-Time PCR检测HSCs的α-SMA和Col1a1的表达,同时也从细胞水平做免疫荧光染色;提取细胞总蛋白,Western blot检测α-SMA、Col1a1,ERK1/2、JNK1/2和p38 MAPK蛋白水平及其磷酸化水平。结果:Western blot检测显示日本血吸虫感染小鼠肝组织TOPK表达升高,免疫荧光也显示感染鼠肝组织中TOPK荧光强度增强。为进一步研究血吸虫感染后肝星状细胞的激活是否也伴随着TOPK的高表达,我们运用灌注法分离出小鼠原代肝星状细胞,结果发现小鼠感染6周后,肝星状细胞也高表达TOPK。日本血吸虫感染的小鼠经尾静脉注射给予TOPK抑制剂HI-TOPK-032进行干预后,肝组织Masson结果说明,肝脏的胶原沉积面积较注射DMSO组明显变小,纤维化的程度也明显减轻,且伴随着肝脏纤维化相关蛋白α-SMA和Col1a1表达的降低。体外培养的肝星状细胞系LX-2在加入TOPK抑制剂后,细胞的活性受到明显抑制,且这种抑制效应具有浓度和时间依赖性;FCM检测发现TOPK抑制后“S”期LX-2细胞比例较DMSO组明显下降,LX-2凋亡比例却上升。此外,TOPK抑制剂处理LX-2细胞后,Western blot和Real-time PCR检测结果显示,肝星状细胞的活化标志α-SMA和Col1a1在蛋白水平和转录水平均较DMSO处理组降低,免疫荧光也显示荧光强度减弱。另外,HI-TOPK-032处理后,LX-2细胞MAPK信号蛋白ERK1/2、JNK1/2及p38 MAPK的蛋白表达虽没有出现明显变化,但它们的磷酸化水平较DMSO组显著降低。结论:血吸虫感染后宿主肝组织中高表达激酶TOPK,特别是活化的肝星状细胞亦表现出TOPK表达水平的升高,而用一定浓度的抑制剂把TOPK的活性抑制后能显著减轻小鼠的肝脏纤维化,该效应与TOPK被抑制后肝星状细胞的活化、细胞增殖水平降低,而细胞凋亡增多有关。同时,TOPK抑制后也下调了肝星状细胞α-SMA和Col1a1的表达水平。TOPK在肝星状细胞活化、增殖和分化过程中所产生的调控效应可能是通过加强胞内MAPK信号JNK1/2、ERK1/2及p38MAPK的磷酸化表达水平来实现的。总而言之,本研究初步证明了TOPK蛋白激酶参与了血吸虫感染所导致的肝星状细胞的活化进而促进肝纤维化的形成,表明TOPK可作为一个潜在的靶点来治疗血吸虫感染所致的肝纤维化。