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磷酸化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰方式,过程是可逆的,广泛存在于真核和原核生物中,几乎参与生命活动的所有过程。植物在生长发育过程中会受到多种不利环境因素的影响,通常植物体会通过诱导表达一系列的蛋白质来抵御或减少温度、水分和盐渍等胁迫因素造成的伤害。在与植物逆境反应相关的蛋白中,胚胎晚期富集蛋白(late embryogenesis abundant protein,LEA)的研究备受关注。LEA蛋白是在植物胚胎发育晚期大量积累的一类蛋白质,很多研究报道其能参与植物多种逆境反应。其家族成员根据序列特征及保守结构域可分为7组,目前关于LEA蛋白的磷酸化研究仅限于2组成员,本研究选择了属于LEA3组的大豆PM18蛋白,对磷酸化修饰是否影响PM18蛋白的抗逆保护功能进行了探讨。在本研究中,我们通过提取大豆胚根R0期总蛋白进行双向电泳分离,利用LC-MS/MS质谱分析检测到PM18蛋白具有S90、Y136和T266三个常见磷酸化位点。为了研究磷酸化修饰与PM18蛋白耐盐功能的关系,我们将3个磷酸化位点进行突变,分别构建了多组能过表达的模拟磷酸化激活型和模拟去磷酸化状态的PM18蛋白的突变体,将其分别转化盐敏感酵母突变株(?nha1、?nhx1)和高渗敏感酵母突变株(?hog1),检测重组酵母在盐胁迫条件下的生长情况,结果表明野生型PM18蛋白能提高盐敏酵母的耐盐性,效果强于磷酸化失活型的PM18蛋白,而激活型效果强于野生型PM18蛋白。利用同样方法,我们也发现S90和Y136位点的磷酸化修饰在提高盐敏感酵母的耐盐能力方面发挥重要作用,而T266位点的磷酸化修饰没有明显效果,进一步的分析还表明S90和Y136位点的磷酸化修饰在抵御盐胁迫过程中表现为协同作用。通过激酶处理体外重组PM18蛋白,得到磷酸化的PM18蛋白。圆二色谱分析结果表明在水溶液中PM18是一个无序蛋白。在TFE和SDS存在条件下,磷酸化修饰的PM18蛋白比没有磷酸化修饰PM18蛋白更容易形成α-螺旋结构。此外,在冻融胁迫条件下,PM18蛋白能有效降低乳酸脱氢酶的活性丧失比率,且磷酸化后的PM18蛋白对乳酸脱氢酶的保护能力相对于非磷酸化的PM18蛋白更好。综上所述,磷酸化修饰对于大豆LEA3组蛋白PM18参与逆境胁迫反应具有一定作用,为LEA蛋白的抗逆机理研究提供了新的思路。