唾液酸带负电荷,广泛存在于哺乳动物细胞表面,在细胞之间的信息传递过程中发挥着非常重要的生物学功能。在医药工业中,以唾液酸为前体的衍生物被越来越多地用于抗病毒药物、治疗神经性疾病药物和诊断试剂等。本论文的研究目的是通过大肠杆菌发酵生产聚唾液酸,水解后得唾液酸单体,最后经分离纯化得到唾液酸晶体。 通过摇瓶实验研究了大肠杆菌发酵过程中菌体生长和产物合成的影响因素,结果表明:产物合成与菌体生长是相耦联的过程,菌体生长受到菌体代谢产物的抑制作用,聚唾液酸的合成不受代谢产物的抑制作用;发酵进入稳定期后菌体的生长和生产能力有所降低;硫酸镁和胰蛋白胨分别对产物合成和菌体生长有一定的促进作用。根据这些结论,在补料液中补充适量的硫酸镁和胰蛋白胨,并对补料分批发酵过程中的补料控制策略进行了研究,采用变速补料方案,最终使菌体量和产物浓度分别提高了40%。 聚唾液酸是大分子物质,与发酵液中其它杂质的性质差别很大,因此,聚唾液酸的分离比唾液酸单体的分离要容易很多。在聚唾液酸的发酵液中,主要的杂质为蛋白质和小分子杂质,探讨了用乙醇分步沉淀法和乙醇沉淀-过滤法脱除杂蛋白的分离工艺条件,并与Sevage试剂法、盐析法脱除蛋白的效果进行了对比,发现乙醇沉淀-过滤法优于其它方法。得到乙醇沉淀-过滤法的最优工艺条件:取10L发酵液经离心去除菌体得到上清液,加30L乙醇,室温下静置沉降后,除去上层清液,加入150g硅藻土过滤,滤饼中加800mL去离子水使聚唾液酸溶解,再次过滤,收集滤液。蛋白质的脱除率达到89.5%,同时聚唾液酸的回收率为94.5%。探讨了凝胶过滤法、阳离子树脂吸附法、中和沉淀法进一步纯化聚唾液酸的工艺,其中中和沉淀法可使聚唾液酸纯度达到91.5%,回收率为55.8%。 聚唾液酸水解过程会产生大量的色素物质,影响唾液酸单体的后继分离。研究了不同脱色剂对聚唾液酸水解液的脱色效果和唾液酸的回收率,确定凹土是这些脱色剂中效果最好的,其脱色率为91.7%,唾液酸的回收率为96.7%。研究了有机溶剂结晶法分离唾液酸的工艺条件,表明乙醇是较为有效的唾液酸结晶溶剂。得到最佳的有机溶剂结晶工艺:聚唾液酸经水解,中和,脱色,脱离子处理后,冷冻干燥,取3g唾液酸冷冻干燥粉末,用100ml,45℃无水乙醇充分溶解,离心除去沉淀,减压浓缩至有少量浑浊产生,加0.5倍体积乙酸乙酯,离心,除去沉淀,继续添加乙酸乙酯,直到没有沉淀析出为止。离心、干燥后得到唾液酸晶体,纯度达到92%。对结晶产品进行了红外扫描,得到的图谱与唾液酸标样(Sigma,typeⅢ)的红外图谱一致。